紀(jì)雯婷 胡京紅 于 雪 范盎然 任 紅 張?zhí)m蘭 劉 敏

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,北京,100029)

麻黃細(xì)辛附子湯出自《傷寒論》,由麻黃、細(xì)辛、附子3味藥組成,臨床上常用于過敏性鼻炎、哮喘等疾病,收效顯著[1-3]。過敏性鼻炎為Th2優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答的炎性反應(yīng)[4-6],其發(fā)生與Th1/Th2的偏移密切相關(guān)。樹突狀細(xì)胞是重要的抗原提呈細(xì)胞,是免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者,對(duì)Th細(xì)胞的分化密切相關(guān)。本文通過麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞的干預(yù)研究,探討麻黃細(xì)辛附子湯治療過敏性鼻炎可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 C57BL/6雄性小鼠6周齡(20±5)g購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，全部小鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心三級(jí)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室溫度為(22±2)℃,濕度60%±5%,正常光照晝夜節(jié)律，維持安靜環(huán)境。

1.1.2 藥物 實(shí)驗(yàn)選用的麻黃細(xì)辛附子湯出自《傷寒論》,麻黃、細(xì)辛、附子均購(gòu)于北京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂。

1.1.3 試劑與儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher scientific公司),離心機(jī)(Eppendorf公司),FCS、RPMI1640培養(yǎng)基為GBICO公司產(chǎn)品,GM-CSF、IL-4來(lái)自R&D公司,STAT6抗體購(gòu)于Proteintech group公司,pSTAT6抗體來(lái)自abcam,Aimplex流式高通量檢測(cè)試劑盒(北京曠博生物技術(shù)股份有限公司),IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3mRNA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓來(lái)源樹突狀細(xì)胞的分離培養(yǎng) C57BL/6J小鼠分離培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[7-8]具體過程為:無(wú)菌條件下將小鼠股骨與脛骨分離,用1 mL注射器吸取RPMI-1640培養(yǎng)液從打孔處將骨髓沖入到干燥無(wú)菌培養(yǎng)皿中,收集骨髓細(xì)胞懸液,用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后,將細(xì)胞重懸于含GM-CSF、IL-4的完全培養(yǎng)基中,密度為2×106個(gè)/mL,種于6孔板中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),隔天半換液,第6天時(shí)收集細(xì)胞備用。

1.2.2 藥物制備與篩選

1.2.2.1 麻黃細(xì)辛附子湯水提液制備 麻黃細(xì)辛附子湯,常用量為麻黃6 g、附子9 g、細(xì)辛3 g,用超純水按比例煎煮藥物1 h,使藥物終濃度達(dá)1 g/mL。12 000 r/min高速離心2次,10 min/次,收集上清,用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌并分裝,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)濃度的篩選 為了篩選適宜濃度的麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞，收集分選的樹突狀細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105,吹打均勻,加入96孔板,每孔100 μL,10倍稀釋等比例稀釋1 g/mL的麻黃附子細(xì)辛湯水提液,按順序加入96空中,每個(gè)濃度的水提液設(shè)6個(gè)復(fù)孔,把細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK8試劑,酶標(biāo)儀測(cè)試1次/0.5 h,并記錄數(shù)據(jù)。調(diào)整水提液濃度,重復(fù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)10 mg/mL以內(nèi)的麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)樹突狀細(xì)胞的毒性很小,實(shí)驗(yàn)選擇麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)濃度為2 mg/mL。

1.2.3 分組與給藥 本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)空白對(duì)照組(C組)與麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)組(M組)。其中，M組用麻黃細(xì)辛附子湯(2 mg/mL)干預(yù)24 h，C組用完全培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)24 h。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.4.1 樹突狀細(xì)胞IL-4、IL-5、IL-13的檢測(cè) 培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞,按2×105種于24孔板,0.5 mL/孔。各組分別干預(yù)24 h后,收集各組細(xì)胞上清,按照Aimplex流式高通量多因子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各組樹突狀細(xì)胞上清中IL-4、IL-13與IL-5的含量。

1.2.4.2 樹突狀細(xì)胞STAT6磷酸化的表達(dá)的檢測(cè) 培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞,按5×106種于6孔板,2 mL/孔。各組分別干預(yù)24 h后,分別收集各組細(xì)胞,檢測(cè)STAT6與pSTAT6蛋白表達(dá)水平。

1.2.4.3 樹突狀細(xì)胞表達(dá)IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA 制備并分選樹突狀細(xì)胞,按2×105種于24孔板,0.5 mL/孔。各組分別干預(yù)24 h后,分別收集各組細(xì)胞,熒光定量PCR法檢測(cè)各組IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA表達(dá)。見表1。

2 結(jié)果

2.1 GM-CSF、IL-4成功誘導(dǎo)單核骨髓細(xì)胞成為樹突狀細(xì)胞 小鼠骨髓單核細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4的刺激下,成功誘導(dǎo)成為樹突狀細(xì)胞。顯微鏡下觀測(cè)可知,誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞成葡萄串樣生長(zhǎng)，細(xì)胞有毛刺樣突起。見圖1。

圖1 骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞(10倍目鏡×20倍物鏡)

2.2 麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞分泌IL-4與IL-13減少，而IL-5的含量沒有明顯變化 IL-4,IL-5以及IL-13均是典型的Th2型細(xì)胞因子。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞24 h后,樹突狀細(xì)胞分泌IL-4的含量減少(P<0.05),分泌IL-13的含量也顯著降低(P<0.01),而IL-5的的含量與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2,圖2?？梢?麻黃細(xì)辛附子湯可直接選擇性降低Th2相關(guān)的細(xì)胞因子,起到抑制過敏性炎性反應(yīng)的作用。

2.3 麻黃細(xì)辛附子湯降低樹突狀細(xì)胞pSTAT6/STAT6比值 麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞24 h后,樹突狀細(xì)胞表達(dá)STAT6水平較空白對(duì)照組無(wú)差異,而pSTAT6的表達(dá)明顯降低(P<0.01),pSTAT6/STAT6比值降低(P<0.05)。見圖3、圖4?？梢娐辄S細(xì)辛附子湯能抑制STAT6磷酸化的水平從而阻止了T細(xì)胞Th2方向分化,起到調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡的作用。

表1 基因引物序列表

表2 各組樹突狀細(xì)胞IL-4、IL-5以及IL-13的表達(dá)情況

注:與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

表3 各組樹突狀細(xì)胞IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA的表達(dá)情況

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 各組樹突狀細(xì)胞IL-4、IL-5以及IL-13的表達(dá)情況

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 各組樹突狀細(xì)胞STAT6與pSTAT6的 Western-blot條帶比較,每組3個(gè)復(fù)孔

2.4 麻黃細(xì)辛附子湯降低樹突狀細(xì)胞IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA的表達(dá) IL-4/STAT6通路是經(jīng)典的Th2激活通路,通過細(xì)胞因子以及蛋白表達(dá)結(jié)果可知,麻黃細(xì)辛附子湯可降低IL-4水平,減少STAT6的磷酸化表達(dá),我們進(jìn)一步通過mRNA水平驗(yàn)證麻黃細(xì)辛附子湯在樹突狀細(xì)胞上的抗炎機(jī)制。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞24 h后,樹突狀細(xì)胞IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3 mRNA的表達(dá)均較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。見表3，圖5?？梢?麻黃細(xì)辛附子湯可通過調(diào)控IL-4 mRNA,STAT6 mRNA以及GATA-3mRNA發(fā)揮抗過敏的作用。

圖4 各組樹突狀細(xì)胞STAT6與pSTAT6蛋白表達(dá)情況

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖5 各組樹突狀細(xì)胞IL-4mRNA、STAT6 mRNA與GATA-3 mRNA表達(dá)比較

注：與C組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

過敏性鼻炎作為TH2優(yōu)勢(shì)免疫應(yīng)答的炎性反應(yīng),其臨床特點(diǎn)為鼻癢、噴嚏、流涕、多遇寒而犯、遷延時(shí)長(zhǎng)、反復(fù)發(fā)作,過敏性鼻炎貌似“外感”,實(shí)為“內(nèi)傷”,通過傳統(tǒng)中醫(yī)思維的辨證分析,可以看出氣虛陽(yáng)衰而外感寒邪是過敏性鼻炎關(guān)鍵病機(jī)[9-10]。麻黃細(xì)辛附子湯配伍嚴(yán)謹(jǐn),將扶陽(yáng),散陽(yáng),通陽(yáng)3個(gè)方面結(jié)合在一起,能扶正祛表,表里兼治,具有治療過敏性鼻炎的理論基礎(chǔ)[11-12]。

樹突狀細(xì)胞是抗原提呈細(xì)胞中攝取提呈抗原能力最強(qiáng)的成員,處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。樹突狀細(xì)胞能活化T細(xì)胞,分泌各種細(xì)胞因子,誘導(dǎo)并促進(jìn)活化的T細(xì)胞分化,對(duì)Th分化起著重要的調(diào)控作用[13-14]。其中,樹突狀細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子如IL-12及IFN-γ等,誘導(dǎo)T細(xì)胞向T細(xì)胞向Th1方向分化[15]。同時(shí),樹突狀細(xì)胞也可IL-4及IL-13等Th2型細(xì)胞因子,誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2方向偏移,造成過敏性疾病的發(fā)生[16]。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞之后,引起IL-4與IL-13的分泌的減少,可起到調(diào)節(jié)Th2分化,改善過敏性疾病的潛質(zhì)。但麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)IL-5的含量影響不大,說明麻黃細(xì)辛附子湯可選擇性的影響Th2型細(xì)胞因子,對(duì)細(xì)胞因子上游具有特殊的調(diào)節(jié)作用。

信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transducers and Activators of Transcription,STAT)是一類具有信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化的胞質(zhì)蛋白家族,其家庭成員包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6[17-18]。STAT6可被IL-4、IL-13激活,活化后的STAT6進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-4、IL-13等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),促進(jìn)IL-4、IL-13等TH2型細(xì)胞因子的分泌,加重了TH2型炎性反應(yīng)的發(fā)生[15-16,19-22]。因此,STAT6作為誘導(dǎo)Th2型變應(yīng)性炎性反應(yīng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,增加了變應(yīng)性炎性反應(yīng)的易感性,在許多過敏性疾病中都引起了研究者們重視。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)樹突狀細(xì)胞后,STAT6磷酸化水平減少,從而阻止了T細(xì)胞Th2方向偏移,調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡,起到治療過敏性鼻炎的作用。

GATA-3 mRNA是Th2的特異性轉(zhuǎn)錄因子[23],作為STAT6的上游[24],激活后指導(dǎo)T細(xì)胞向Th2方向分化。麻黃細(xì)辛附子湯干預(yù)后樹突狀細(xì)胞IL-4 mRNA、STAT6 mRNA以及GATA-3 mRNA的表達(dá)均下降,說明麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)Th2經(jīng)典通路IL-4/STAT6具有調(diào)控作用,可發(fā)揮調(diào)節(jié)過敏性鼻炎的作用。

總之,麻黃細(xì)辛附子湯減少IL-4、IL-13分泌,降低pSTAT6水平,降低IL-4 mRNA、STAT6 mRNA及GATAT-3 mRNA含量,負(fù)反饋樹突狀細(xì)胞IL-4/STAT6通路,使樹突狀細(xì)胞抑制T細(xì)胞Th2方向分化,調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡,從而發(fā)揮治療過敏性鼻炎的作用。