李君玲 馬雪玲 李玉波 夏 愷 王 田 薛曉興 趙慧輝 王 偉

(1 首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京，100069； 2 北京中醫(yī)藥大學，北京，100029； 3 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京，100700)

抑郁癥是以情緒低落、思維遲緩、意志活動減退為主要特征的綜合征[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)公布的資料顯示，抑郁癥是全球范圍內(nèi)引起致殘率的第3大疾病，并將于2030年成為最大疾病負擔源[2]。然而，目前臨床中僅有<50%的患者對現(xiàn)代的一線抗抑郁藥有良性反應，<30%的患者能夠得到痊愈[3]。因此，尋找更多有效的治療手段已成為目前的研究熱點。中醫(yī)學是祖國傳統(tǒng)文化的寶庫，從中醫(yī)學中挖掘抑郁癥的解決方法越來越受到學者們的關注。然而，中醫(yī)臨床治療的核心是辨證論治[4]，證候是中醫(yī)治療的基礎和前提，因此研究中醫(yī)對抑郁癥證候認識的生物學基礎是從中醫(yī)學中尋找抑郁癥解決辦法的根本途徑。肝郁脾虛證是中醫(yī)臨床治療抑郁癥的常見證型，中醫(yī)臨床治療肝郁脾虛型抑郁癥往往療效顯著[5-7]，因此運用現(xiàn)代手段研究肝郁脾虛型抑郁癥的生物學基礎是從中醫(yī)學中尋找治療抑郁癥的重要途徑之一。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是目前研究抑郁證發(fā)病機制較為常用的指標，然而，對于抑郁癥肝郁脾虛證的中樞生物學基礎，究竟選擇哪些腦區(qū)進行研究更有針對性，一直是研究者們所爭論和探討的。磁共振功能成像(Functional Magnetic Resonance Imaging，fMRI)，是一種新型的、無創(chuàng)的、并且可動態(tài)進行檢測的技術(shù)，可以記錄靜息態(tài)大鼠的腦部功能，從全腦范圍內(nèi)尋找模型動物的異常腦區(qū)，從而為系統(tǒng)的探索疾病發(fā)病相關的腦區(qū)提供了一種影像學方法。因此本研究首先利用fMRI的方法對肝郁脾虛型抑郁癥大鼠的異常腦區(qū)進行探索，在功能核磁所探索的基礎上對密切相關腦區(qū)進行單胺類神經(jīng)遞質(zhì)檢測，從而對肝郁脾虛型抑郁證的關鍵中樞分子生物學基礎進行探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級6周齡雄性SD大鼠110只，適應性喂養(yǎng)一周，據(jù)體重平均分為2組：正常組21只，慢性不可預知溫和應激(Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS)組(CUMS組)89只。正常組4～5只/籠飼養(yǎng)，CUMS組單籠飼養(yǎng)并予以應激。6周后，對模型大鼠進行病證模型評價及篩選(根據(jù)病證模型判定方法，最終為54只符合標準)。將篩選的大鼠根據(jù)行為學測試結(jié)果平均分為3組：1)M(模型)組：22只；2)S(四逆散)組：14只；3)F(氟西汀)組：18只；Z(正常)組大鼠不變：21只。

1.1.2 動物造模與模型篩選 采用CUMS的方法進行造模，具體的應激方法如下：禁水24 h，禁食24 h，鼠籠傾斜(45°)12 h，潮濕墊料8 h，冷水(4 ℃)游泳5 min，束縛2.5 h，2籠合并12 h，照明24 h，夾尾1.5 min，36 V電壓電擊1 min，間隔30 s共45 min/次。每日的應激方式由2種不同應激方法組成，1周內(nèi)不允許連續(xù)使用同一種應激方式，應激共持續(xù)8周。

1.1.3 模型判定 前期實驗發(fā)現(xiàn)，SD雄性大鼠CUMS刺激6～8周呈現(xiàn)穩(wěn)定的肝郁脾虛型抑郁癥[8]，因此本研究在第6周，采用將肝郁脾虛型抑郁癥證臨床癥狀判定標準等效轉(zhuǎn)化為大鼠宏觀表征的方式，采用行為學實驗中的糖水偏好實驗和體重測定及宏觀表征觀察相結(jié)合的方法，對大鼠進行抑郁癥(病)、肝郁脾虛證(證)的判別及篩選，具體轉(zhuǎn)換方式為：1)臨床中抑郁癥患者出現(xiàn)的情緒抑郁轉(zhuǎn)換為動物的糖水偏好實驗中的糖水偏好度減低與曠場實驗中的自主活動度(如穿格總距離和直立次數(shù))降低；2)臨床患者的兩脅脹痛轉(zhuǎn)換為大鼠的抓取反抗激烈的表現(xiàn)；3)臨床中患者的食欲降低轉(zhuǎn)換為大鼠的體重增長緩慢；4)臨床中的大便稀溏轉(zhuǎn)換為大鼠的大便稀軟不成形；5)臨床出現(xiàn)的腸鳴矢氣癥狀轉(zhuǎn)換為大鼠的拉尾排便次數(shù)增多。經(jīng)測試后，大鼠中同時具有前4項癥狀的3項(其中前2項癥狀必須具備)或者具有前2項癥狀加第5項癥狀即可判斷為肝郁脾虛型抑郁癥大鼠。

1.2 方法

1.2.1 腦功能核磁數(shù)據(jù)采集 在應激8周后，從正常組和模型組中隨機抽取6只進行核磁檢驗。采用7.0T小動物功能核磁儀(Bruker，德國)進行大鼠全腦掃描。使用5%異氟烷將大鼠麻醉后，置于掃描臺，借助麻醉面罩通以持續(xù)1～1.5%異氟烷(維持呼吸頻率：40～50次/min)并加頭部固定裝置固定頭部，以確保大鼠檢測過程不會掙扎。具體掃描步驟與相關參數(shù)如下：1)掃面T2加權(quán)像，設置參數(shù)如下：視野3.3 cm×3.3 cm，重復時間4 380 ms，回波時間45 ms，矩陣256×256，層數(shù)30層。2)掃面靜息態(tài)BOLD，設置參數(shù)如下：視野2.5 cm×2.0 cm，重復時間3 280 ms，層數(shù)20層，層厚/間隙1.0 mm/0.2 mm，回波時間27.6 ms，轉(zhuǎn)角90°，矩陣128×128。

1.2.2 給藥方案 在北京康仁堂制備經(jīng)典方劑組成的四逆散免煎顆粒備用，參照臨床用量向動物給藥劑量的轉(zhuǎn)換系數(shù)(6.25倍)[8-9]，以2.5 g/(kg·d)用量對S組大鼠進行灌胃。氟西汀為禮來公司的20 mg膠囊，以2 mg/kg/日用量對F組大鼠進行灌胃。M組與Z組大鼠以1 mL/100 g劑量灌胃蒸餾水。每日應激前30 min進行灌胃。持續(xù)給藥2周，給藥過程中應激不停止。

1.2.3 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)檢測 8周后，大鼠斷頭，迅速剝離下丘腦儲存于-80 ℃冰箱中備測。各組隨機選取7只大鼠的下丘腦標本進行高效液相單胺類神經(jīng)遞質(zhì)檢測,具體步驟如下:1)蛋白沉淀劑的配制：0.1 mol/L高氯酸溶液(含有0.3 mMEDTA-2Na和0.5 mMolNa2SO3)；2)標準品溶液的配制：用配制好的蛋白沉淀劑分別溶解DA、DOPAC、NE、5-HT、5-HIAA、HVA等標準品，使其濃度均為100 μg/mL；3)樣品的處理：從-80 ℃冰箱中迅速取出凍存的樣品，稱重后，加入3倍重量體積的蛋白沉淀劑，采用超聲細胞粉碎機對組織進行勻漿(冰上進行以防溫度過高)，靜置10 min，12 000 r/min的速度進行離心10 min，吸取上清液后，相同條件再次離心，吸取20 μL上清液進樣檢測；4)上機檢測的各項條件：Alliance2695型號高效液相色譜儀。ECD2465型號電化學檢測器：玻碳工作電極和Ag/AgCl參比電極，+0.75V檢測電壓。色譜柱：Atlantis C18，2.1×150 mm，3 μm。35 ℃柱溫，流動相：50 mM檸檬酸-乙酸鈉(內(nèi)含1 mM B8離子對試劑，4%CH3OH，1.8 mMC8H19N，0.3 mM Na2EDTA，pH為3.5。)，流速為0.35毫升/分。5)樣品檢測：每一次樣品測試前將混標進樣進行質(zhì)控。分別配制0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2 ppm11個不同濃度，均以20 μL的量進樣，并記錄不同濃度下的色譜峰面積。以混標溶液的濃度作X軸，所測出的色譜峰面積作Y軸，建立濃度-峰面積標準曲線，通過該標準曲線，計算每個檢測樣品的濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

1.3.1 理化指標數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0(Chicago，IL，USA)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析分析。Shapiro-Wilk檢驗來檢測實驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。根據(jù)正態(tài)檢驗及方差分析結(jié)果，分別采用單因素方差分析(各組符合正態(tài)分布且方差齊)、2組獨立樣本非參數(shù)檢驗(各組均不符合正態(tài)分布)、Tamhane檢驗或非參數(shù)檢驗(符合正態(tài)分布但不具備方差齊性)的方法對各組進行兩兩比較。

1.3.2 核磁數(shù)據(jù)分析 核磁數(shù)據(jù)委托中國中醫(yī)科學院高能物理研究所利用SPM8軟件進行全腦的ALFF和Reho的指標分析，具體步驟如下：1)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)，篩選可以分析的高質(zhì)量圖像。2)校正時間片：將中間層作為標準，對所有受試個體的所有volume，對其余層的時間信息進行校正。3)頭動校正：對所有受試體，將其第一幅圖像作參考標準進行空間校正，生成校正后的以及150副校正后圖像的平均圖像。4)空間標準化：將第3步所成的平均圖像作為源圖像，確定圖像的配準參數(shù)，并將該參數(shù)應用于第3步所生成的150副圖像上。5)高斯平滑：利用高斯平滑核[半高寬為(3 6 3)mm]對空間標準化的圖像進行平滑，以使所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。6)去線性漂移、帶通濾波：機器噪聲等線性影響利用線性回歸的方法進行去除。帶通頻段濾波(0.01～0.08 Hz)來減小低頻或高頻漂移。7)ALFF測定：對濾波后的數(shù)據(jù)進行低頻振蕩幅度值的計算。8)ReHo測定：肯德爾和諧系數(shù)被用來計算包含27個體素在內(nèi)的每個團塊的時間序列變化的一致性。9)統(tǒng)計分析：對預處理后的所有圖像進行基于廣義線性模型的隨機效應分析，包括ALFF、ReHo。對于正常組和模型組的預處理后的數(shù)據(jù)，利用SPM8軟件進行雙樣本t檢驗的統(tǒng)計分析。10)ALFF與Reho結(jié)果顯示：個體的體素閾值P<0.001(未校正)、體簇大小>54個體素，認為是具有統(tǒng)計學差異的激活腦區(qū)，最后得出正常組和模型組之間的統(tǒng)計參數(shù)圖。

2 結(jié)果

2.1 腦靜息態(tài)BOLD 應激8周后，模型組較正常組的Reho和ALFF信號均呈現(xiàn)減弱現(xiàn)象，其中在海馬、下丘腦、中腦被蓋部、嗅皮層、梨狀皮層、腦橋的6個腦區(qū)Reho信號均減弱。在小腦、下丘腦、腦橋3個腦區(qū)ALFF信號均減弱。見圖1。

圖1 正常大鼠與肝郁脾虛型抑郁癥大鼠Reho和ALFF的統(tǒng)計參數(shù)圖

注：每幅圖的左側(cè)底部數(shù)字代表Paxinos&Watson所著的2005版大鼠腦立體定位圖譜中的z坐標值。右側(cè)底部的色階代表2組比較的t值大小(顏色越亮，代表t值越大)。每幅腦圖上的激活點為具有統(tǒng)計學意義的腦區(qū)(AlphaSim以校正全部團塊內(nèi)體素，P<0.001，團塊大小>50 voxels)，激活點分別代表的腦區(qū)為：1.腦橋；2.海馬；3.嗅皮層；4.中腦被蓋部；5.梨狀皮層；6.下丘腦；7.小腦

2.2 下丘腦神經(jīng)遞質(zhì) 根據(jù)功能核磁分析的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛型抑郁癥大鼠下丘腦在Reho和ALFF2個指標中均存在明顯的改變，因此我們進一步對下丘腦的神經(jīng)遞質(zhì)進行了檢測。DA：模型組較正常組下丘腦DA含量顯著降低，氟西汀組與正常組和模型組比較，均有顯著升高；四逆散組與模型組比較有改善趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，與正常組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；DOPAC、HVA：下丘腦DOPAC、HVA含量各組之間差異無統(tǒng)計學意義；5-HT:模型組與正常組比較，下丘腦5-HT含量顯著降低，四逆散組和氟西汀組較模型組比較，含量顯著升高;5-HIAA：模型組和氟西汀組與正常組比較，下丘腦5-HIAA含量顯著降低，其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義;NE：模型組與正常組比較，下丘腦NE含量顯著降低，四逆散與氟西汀組較模型組比較有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。見圖2～7。

圖2 各組DA含量比較結(jié)果

注：與正常組比較，*P≤0.05；與模型組比較，△P≤0.05

圖3 各組DOPAC含量比較結(jié)果

注：與正常組比較，*P≤0.05；與模型組比較，△P≤0.05

圖4 各組HVA含量比較結(jié)果

注：與正常組比較*P≤0.05；與模型組比較，△P≤0.05

圖5 各組5-HT含量比較結(jié)果

注：與正常組比較*P≤0.05；與模型組比較，△P≤0.05

圖6 各組5-HIAA含量比較結(jié)果

注：與正常組比較,*P≤0.05;與模型組比較，△P≤0.05

圖7 各組NE含量比較結(jié)果

注：與正常組比較,*P≤0.05;與模型組比較，△P≤0.05

3 討論

肝郁脾虛證是抑郁癥疾病中的常見證型，本研究參照前期實驗研究中大鼠抑郁癥肝郁脾虛證的造模、評價方法及所確定的穩(wěn)定時間窗[9]，在慢性應激第8周，首先利用磁共振功能成像的方法，對肝郁脾虛型抑郁癥大鼠的相關異常腦區(qū)進行了篩選，并基于腦功能核磁的結(jié)果，利用高效液相的方法，對所檢測到的密切相關腦區(qū)——下丘腦進行了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的檢測，同時利用疏肝祖方——四逆散進行方劑反證，確定了與肝郁脾虛型抑郁癥大鼠密切相關的中樞分子生物學基礎為下丘腦5-HT、5-HIAA、NE和DA。

研究表明，靜息態(tài)功能磁共振成像(Resting-state Functional Magnetic Resonance Imaging，r-fMRI)是研究機體自發(fā)或者固有神經(jīng)腦活動的影像方法[10]，由于這種方法不需要給予檢測者各種任務、檢測靈敏，方法可靠[5]，因此也是目前研究鼠類或其他需麻醉的動物的腦功能的常用方法[10-12]。低頻震蕩(Amplitude of the Low-frequency Fluctuations，ALFF)和局部一致性(Regional Homogeneity，ReHo)是探索靜息態(tài)全腦神經(jīng)元振幅和局部一致性異常腦區(qū)的2種方法[13-14]。本研究采用2種方法相結(jié)合的方法，檢測到與抑郁癥肝郁脾虛證大鼠相關的腦區(qū)包含海馬、下丘腦、中腦被蓋部、嗅皮層、梨狀皮層、腦橋、小腦，其中在使用ALFF和Reho這2種分析方法時，均檢測到下丘腦和腦橋的異常神經(jīng)活動改變。腦橋在抑郁癥的研究中并不多見，目前公認的功能多為調(diào)節(jié)呼吸和肌肉運動。然而目前也有臨床研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者出現(xiàn)腦橋的Reho信號改變，與本研究的結(jié)果一致[15]。下丘腦-垂體-腎上腺軸的改變是歷來被公認的抑郁癥發(fā)病的機制之一[16-17]，同時下丘腦是調(diào)節(jié)機體穩(wěn)態(tài)的重要中樞腦區(qū)，在調(diào)節(jié)機體的代謝、水平衡、饑餓感、生殖、節(jié)律及情緒反應中都起到重要作用，是大腦皮質(zhì)下調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動的高級中樞[18]，本實驗的核磁結(jié)果顯示肝郁脾虛型抑郁癥大鼠的下丘腦ALFF和Reho均存在異常改變，符合肝郁脾虛型抑郁癥大鼠情緒抑郁與消化道癥狀并存的狀態(tài)。因此我們將下丘腦作為研究肝郁脾虛型抑郁癥大鼠中樞分子生物學基礎的重點觀察腦區(qū)。

在此基礎上，本研究利用高效液相色譜法方法對肝郁脾虛型抑郁癥模型的下丘腦的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、NE及其代謝產(chǎn)物5-HIAA、DOPAC進行了檢測，并且觀察了疏肝祖方——四逆散對下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的療效，從而從模型和方劑反證的角度證明下丘腦5-HT、5-HIAA、NE和DA是肝郁脾虛型抑郁癥的重要分子生物學基礎，也是疏肝祖方四逆散發(fā)揮抗抑郁效應的機制之一。5-HT是一種重要的由腦干中縫核中的5-HT能神經(jīng)元合成的神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT功能活動的降低是抑郁癥患者出現(xiàn)抑郁心態(tài)、性功能減弱、食欲下降、內(nèi)分泌紊亂等癥狀的重要原因之一，也是目前抗抑郁藥物發(fā)揮抗抑郁療效的重要靶標之一[19]。NE是一種與睡眠和覺醒調(diào)節(jié)、學習和記憶、選擇性注意、應激反應以及獎賞系統(tǒng)等有關的中樞神經(jīng)遞質(zhì)。目前學者們普遍認為中樞5-HT、NE缺乏能引起抑郁，而升高5-HT、NE可以有效改善抑郁狀態(tài)[20]，本研究中肝郁脾虛型抑郁癥模型大鼠出現(xiàn)5-HT、NE水平都降低的現(xiàn)象可能是與肝郁脾虛證的抑郁狀態(tài)有關，而四逆散對5-HT水平的改善較為顯著，對NE水平的改善不甚顯著，說明下丘腦5-HT的水平下降可能與肝郁脾虛證出現(xiàn)的脾虛癥狀更為密切；中樞多巴胺系統(tǒng)是體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，中樞DA含量變化對情緒以及行為的調(diào)節(jié)均起重要的作用，然而，目前實驗研究中對于抑郁癥不同腦區(qū)DA含量的變化，結(jié)論不一[21]，本研究結(jié)果顯示肝郁脾虛型抑郁癥大鼠下丘腦DA水平呈減少狀態(tài)。

總之，本研究利用先進的功能核磁影像學方法，通過2種核磁分析方法，對全腦腦區(qū)進行探查，篩選出與肝郁脾虛型抑郁癥最為密切相關的腦區(qū)，在確定腦區(qū)的基礎上，對其單胺類神經(jīng)遞質(zhì)進行檢測，并采用疏肝方劑進行方劑反證，較為嚴謹?shù)膶Ω斡羝⑻撔鸵钟舭Y中樞的分子生物學基礎進行了初步探索和研究，也為研究中醫(yī)中的疏肝療法治療抑郁癥的分子生物學機制提供了線索，值得注意的是，由于研究時間有限，本研究僅對ALFF和Reho這2種方法均探測到的腦區(qū)—下丘腦進行了分子生物學的檢測，對于2種方法檢測到的其他腦區(qū)未來如海馬、中腦被蓋部、嗅皮層、梨狀皮層、腦橋、小腦等尤其是腦橋未進行分子生物學的檢測，未來應完善這些腦區(qū)的分子生物學檢測，以達到更為系統(tǒng)全面的探究肝郁脾虛型抑郁癥生物學基礎的目的。同時由于本研究的研究對象——肝郁脾虛型抑郁癥模型，其抑郁狀態(tài)較為嚴重，因此，僅僅兩周的四逆散治療，其抗抑郁療效不太顯著，因此，在以后的研究中，若對四逆散的抗抑郁機制進行研究，其治療時間可能需要適量延長。

(2018-04-20收稿 責任編輯：張文婷)