蘇寶威，白明輝，劉海潮

膽囊癌是指發(fā)生于膽囊體、底、頸及膽管的惡性腫瘤，是膽道系統(tǒng)常見的惡性程度較高的腫瘤，發(fā)病率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中高居第6位［1］。膽囊癌發(fā)病率地域差別大，且與人種有關(guān)，亞洲及拉美地區(qū)高發(fā)；近年來，我國膽囊癌的發(fā)病率呈增高趨勢。膽囊癌惡性程度高，整體5年生存率＜5.0%，中位生存期＜6個(gè)月［2］。目前延長膽囊癌患者生存期的唯一有效方法是根治性切除［3］，但膽囊癌早期癥狀缺乏特異性，診斷時(shí)大多已是中晚期，只有＜25%可切除，且50%左右出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［1］，預(yù)后極差［4-5］。因此能否早期診斷膽囊癌就尤為重要，近年來已有較多研究尋找膽囊癌的生物學(xué)標(biāo)志物，期望能為早期診斷膽囊癌并改善其預(yù)后提供幫助［6］。富含脯氨酸蛋白11（proline-rich protein 11，PRR11）已被證實(shí)在多種腫瘤如肺癌、胃癌、胰腺癌及骨肉瘤等中發(fā)揮作用，且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程［7］，但目前鮮見有PRR11與膽囊癌關(guān)系的研究。本研究試圖分析膽囊中PRR11的表達(dá)情況以探討其與膽囊癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 為鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院2014年10月—2017年10月手術(shù)切除的標(biāo)本，經(jīng)病理證實(shí)膽囊癌組58例，其中男28例，女30例，年齡32～84歲，中位年齡56.7歲。組織學(xué)類型分類：腺癌48例，鱗癌10例。Nevein分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期19例，Ⅴ期13例。病理分級(jí)：高分化癌14例，中分化癌21例，低分化癌23例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例。所有標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)：膽囊癌患者均無腫瘤病史，術(shù)前未接受化療、放療及生物治療等，其病歷資料完整。隨機(jī)選取同期慢性膽囊炎49例作為對照組。兔抗人PRR11單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，S-P試劑盒，磷酸鹽緩沖液（PBS），DAB顯色試劑盒和抗原修復(fù)液均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。其他設(shè)備及試劑由鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及病理科提供。

1.2 免疫組化SP法染色 取所有標(biāo)本的石蠟切片（4 μm厚），常規(guī)脫蠟水化，PBS洗滌5 min，修復(fù)抗原：枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸2 min，7 min后自然冷卻到室溫，PBS清洗3次；3%H2O2室溫下浸泡10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下孵育30 min，PBS洗滌3次；10%山羊血清封閉抗原90 min；加入兔抗人PRR11多克隆抗體4℃過夜；室溫下復(fù)溫30 min，PBS洗滌3次；加辣根過氧化物標(biāo)記過的羊抗兔IgG（稀釋度1∶500），37 ℃反應(yīng)45 min，PBS洗滌3次；加入S-A-HRP工作液于濕盒中37℃反應(yīng)40 min，PBS洗滌3次；DAB顯色，PBS洗滌3次；蘇木素復(fù)染2 min，PBS洗滌3次。梯度乙醇脫水透明后封片。用已知陽性標(biāo)本作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 每張切片均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生采用雙人盲法閱片讀取結(jié)果。PRR11表達(dá)陽性細(xì)胞在膽囊癌中呈棕褐色或（和）棕黃色，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)與染色強(qiáng)度相結(jié)合的二級(jí)計(jì)分法對PRR11蛋白陽性表達(dá)結(jié)果進(jìn)行判定［8］。著色強(qiáng)度為0級(jí)（無著色/-）計(jì)0分，1級(jí)（黃色/+）計(jì)1分，2級(jí)（棕黃色/++）計(jì)2分，3級(jí)（棕褐色/+++）計(jì)3分。陽性細(xì)胞百分比≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分?？偡钟申栃约?xì)胞百分比及著色強(qiáng)度兩項(xiàng)計(jì)分相乘所得，總分＜4分為陰性，總分≥4分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，3組間多重比較時(shí)P＜0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRR11在膽囊癌、癌旁組織及慢性膽囊炎組織中的表達(dá) PRR11主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，陽性顆粒呈棕黃色或棕褐色分布，見圖1。膽囊癌組織、癌旁組織和慢性膽囊炎組織中PRR11陽性表達(dá)率分別為55.2%（32/58）、25.9%（15/58）和4.1%（2/49），膽囊癌組織中PRR11陽性表達(dá)率高于癌旁組織、慢性膽囊炎組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為10.337、26.504，均P＜0.01）。

2.2 PRR11表達(dá)與膽囊癌臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系 不同年齡、性別、組織學(xué)類型分組膽囊癌患者癌組織中PRR11陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，臨床分期Ⅲ～Ⅴ期組陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期組，病理分級(jí)中低分化組陽性表達(dá)率高于高分化組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Relationship between PRR11 expression and clinicopathological parameters of gallbladder carcinoma表1 PRR11表達(dá)與膽囊癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 例（%）

3 討論

Fig.1 Immunohistochemical detection of PRR11 expression(×200)圖1 不同組織免疫組化檢測PRR11的表達(dá)（×200）

PRR11基因是新發(fā)現(xiàn)的一種參與細(xì)胞周期調(diào)控、與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，位于人染色體17q22，由9個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子組成，翻譯起始密碼子位于第2個(gè)外顯子，終止密碼子位于最后1個(gè)外顯子［9］，該基因與目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因BRIP1、RPS6KB1、PPM1D 及 TRIM37等共同位于17q22區(qū)，其編碼的蛋白分子質(zhì)量為40 ku，含360個(gè)氨基酸，有1個(gè)二聯(lián)核定位信號(hào)，1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和2個(gè)脯氨酸富集區(qū)域。目前認(rèn)為，惡性腫瘤的生物學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞的失控性生長，而其根本原因是細(xì)胞周期的調(diào)控紊亂［10］。研究表明，敲除PRR11可阻滯細(xì)胞周期在S期，PRR11下調(diào)表達(dá)也導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G2期，從而抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，阻滯細(xì)胞DNA的合成和有絲分裂的正常進(jìn)行，使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂［11］，因此推測PRR11在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有非常重要的作用。

本研究顯示結(jié)果發(fā)現(xiàn)，58例膽囊癌組織中PRR11呈陽性表達(dá)的有32例，陽性率高達(dá)55.2%，明顯高于其在癌旁組織（25.9%）和慢性膽囊炎組織（4.1%），Nevein分期Ⅲ～Ⅴ期組PRR11陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期組，提示PRR11在膽囊癌的發(fā)生過程中起一定作用。PRR11在中低分化癌組織中的表達(dá)（65.9%）顯著高于其在高分化癌組織中的表達(dá)（21.4%），推測PRR11促進(jìn)了膽囊癌的惡性生物學(xué)行為。此外PRR11蛋白的陽性表達(dá)率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示其可能增強(qiáng)了膽囊癌的浸潤侵襲能力。而PRR11在膽囊癌組織中的表達(dá)與膽囊癌患者的性別、年齡等無關(guān)；這與PRR11在肺癌和胰腺癌［11-12］中的表達(dá)一致。宋宗昌等［13］研究發(fā)現(xiàn)PRR11表達(dá)下調(diào)可以顯著抑制胃癌HGC-27細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并可導(dǎo)致其侵襲相關(guān)蛋白cyclinD1蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2蛋白表達(dá)下降。張小軍等［14］研究顯示，通過下調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞SaOS2中PRR11的表達(dá)，可使G0～G1期的細(xì)胞比例明顯增大，而S期細(xì)胞比例明顯減少，推測PRR11蛋白推動(dòng)骨肉瘤細(xì)胞從S期向G2/M期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，聯(lián)合張春東等［11］的研究可見PRR11對細(xì)胞周期的調(diào)控是多方面的。因此PRR11不僅對腫瘤的發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞周期有影響，而且還可誘導(dǎo)腫瘤侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。另有研究提示敲除PRR11還可以使參與細(xì)胞周期、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移關(guān)鍵通路中的重要基因如RRM1、EPB41L3、CCNA1和MAP4K4等表達(dá)下調(diào)，共同影響腫瘤形成的過程［15］。當(dāng)然影響膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移的因素非常復(fù)雜，影響細(xì)胞周期的因素也很多，PRR11只是其中之一。

綜上所述，PRR11與膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲等密切相關(guān)，但PRR11對腫瘤調(diào)控的機(jī)制非常復(fù)雜，具體還需進(jìn)一步研究。