賈龍梅，殷香寶，曾磊，陳新，饒燕飛

肝細胞肝癌（HCC）是最常見的肝臟原發(fā)性腫瘤［1］。由于臨床癥狀隱匿且易發(fā)生轉移，大部分HCC患者被診斷時即已經(jīng)是腫瘤晚期，因而失去了手術或者肝移植的機會［2］。闡明HCC轉移的分子機制對于防治肝癌有著重要的意義。研究表明，表觀遺傳學的改變對腫瘤的診斷和治療有重大意義［3-4］，大量的證據(jù)表明DNA或者組蛋白甲基化導致的抑癌基因轉錄沉默與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關［5］。SETDB2是一種組蛋白甲基轉移酶，可使組蛋白H3第9位賴氨酸殘基（H3K9）發(fā)生三甲基化（H3K9me3），其包含1個分成兩段的SET區(qū)域、1個前置的SET區(qū)域和1個甲基化的CpG結合區(qū)域，可通過抑制成纖維細胞生長因子8（FGF8）的轉錄活性調控石斑魚胚胎發(fā)育［6］。最新研究表明SETDB2在胃癌中高表達，并通過沉默抑癌基因WWOX和CADM1促進胃癌的侵襲遷移［7］，但SETDB2在肝癌中的表達水平以及對肝癌的侵襲轉移的影響及其分子機制并不清楚。本研究旨在闡明SETDB2對肝癌侵襲遷移的影響及其分子機制，為肝癌的防治提供新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例標本 收集2017年1月—6月我院手術切除的37例肝癌及對應癌旁組織標本，經(jīng)病理學檢查，所有癌組織標本均確診為HCC，癌旁組織標本為正常肝組織。所有患者術前均未接受放化療，其中男29例，女8例，平均年齡（53.4±2.5）歲，標本收集后立即液氮保存或者浸泡在10%福爾馬林溶液中。標本均由患者本人知情同意并通過南昌大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會審核同意后收集。

1.1.2 細胞及試劑 肝癌細胞株MHCC97H購于中國科學院上海細胞庫，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。即用型免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。LipofectaminTM3000、Trizol試劑購自Invitrogen公司（美國）；逆轉錄及PCR試劑盒購自TAKARA生物工程有限公司；Transwell小室購買于Corning公司（美國）；靶向SETDB2的短發(fā)卡RNA（sh-SETDB2）和靶向PTEN的短發(fā)卡RNA（sh-PTEN）及對應的空載體對照質粒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。兔抗人SETDB2和PTEN多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人H3K9me3多克隆抗體以及SimpleChIP?Enzymatic Chromatin IP Kit（Magnetic Beads）購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司；鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Proteintech。羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。SETDB2、PTEN和GAPDH引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Western blot法檢測蛋白的表達 將收集的肝癌組織、癌旁組織和培養(yǎng)的肝癌細胞用RIPA裂解液（含PMSF）裂解后提取細胞總蛋白。制備的蛋白樣本經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離，然后以260 mA恒流電轉移2 h將蛋白轉印至PVDF膜上。室溫下在含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h；加入1∶500稀釋的一抗（SETDB2、PTEN、H3K9me3和GAPDH），4℃反應過夜；TBST漂洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗（1∶10 000），室溫下反應l h；再次用TBST漂洗3次，每次10 min，加入化學發(fā)光試劑顯影成像，ECL發(fā)光系統(tǒng)曝光檢測。采用Image J分析所得圖像，SETDB2/GAPDH、PTEN/GAPDH和H3K9me3/GAPDH灰度比值分別表示SETDB2、PTEN和H3K9me3蛋白相對表達水平。

1.2.2 免疫組織化學染色檢測組織蛋白表達 采用免疫組化EnVision兩步法。將浸泡在10%福爾馬林的肝癌組織和對應的癌旁組織用石蠟包埋，然后按照3～4 μm厚度組織切片，經(jīng)過脫蠟、梯度乙醇水化、PBS清洗、抗原修復等過程后，滴加SETDB2抗體，孵育，滴加增強復合物和二抗，37℃孵育30 min，PBS清洗后，DAB試劑盒顯色，蘇木精復染細胞核，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水，二甲苯透明30 min，中性樹膠和蓋玻片封片。用奧林巴斯顯微鏡采集圖像，以PBS作為陰性對照，同時設空白對照，已知陽性片作為陽性對照，根據(jù)染色程度判定SETDB2蛋白的表達情況，染色越強，表達越高。肝癌組織中SETDB2表達強于癌旁組織的病例納入為高表達組，低于癌旁組織的病例納入為低表達組。

1.2.3 Real-time PCR檢測mRNA表達情況 Trizol法分別提取肝癌組織、癌旁組織和培養(yǎng)的肝癌細胞中的RNA并逆轉錄成cDNA（反應條件：37℃15 min，85℃ 5 s）。然后以cDNA為模板應用SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RnaseH Plus）進行PCR擴增。PCR反應條件：95℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。SETDB2引物：上游5'-CCATTTCACAGGCGAT?GCAA-3'，下游5'-GGTGGCAGACCCATCTTTGA-3'；PTEN引物：上游5'-TGTAAAGCTGGAAAGGGACGA-3'，下游5'-GGGAATAGTTACTCCCTTTTTG-3'；GAPDH引物：上游5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'，下游5'-GCGCCCAATAC?GACCAAATC-3'。使用 2-ΔΔCt分析法分析 SETDB2、PTEN mRNA的表達水平，實驗獨立重復3次。

1.2.4 sh-SETDB2質粒和sh-PTEN質粒及對應的空載體對照質粒的提取 取少量靶向SETDB2的短發(fā)卡RNA（shSETDB2）質粒和靶向PTEN的短發(fā)卡RNA（shPTEN）質粒及對應的空載體對照質粒的菌液接種于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱內搖晃8 h，先小量擴增菌液，然后再倒入500 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱內搖晃過夜，大量擴增菌液。按照質粒提取試劑盒的說明書步驟提取質粒，備用。

1.2.5 細胞轉染及穩(wěn)轉細胞的構建 將MHCC97H細胞接種于6 cm2培養(yǎng)皿中，待細胞長到70%時換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照LipofectamineTM3000轉染試劑操作說明分別將20 μg空載體質粒（shNC）和20 μg shSETDB2轉染入細胞，靜置6 h后換有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，用遺傳霉素（G418）篩選陽性克隆；挑選陽性的單克隆細胞簇，在低劑量G418的條件下將單克隆細胞擴大培養(yǎng)，同時采用Western blot和Realtime PCR法對穩(wěn)定轉染的細胞株進行鑒定。轉染空載體質粒的細胞記為shNC-MHCC97H，轉染shSETDB2質粒的細胞記為shSETDB2-MHCC97H。

1.2.6 Tanswell實驗檢測細胞的侵襲能力 取對數(shù)生長期的shNC-MHCC97H和shSETDB2-MHCC97H細胞，經(jīng)胰酶消化并計數(shù)后，取約1×105個細胞加入Transwell小室，用不含血清的培養(yǎng)液在5%CO2、37℃封閉環(huán)境下孵育36 h，甲醛固定20 min，0.1%結晶紫染色30 min，PBS洗3～5遍。顯微鏡下計數(shù)穿到濾膜外表面的細胞數(shù)，細胞數(shù)越多說明細胞的侵襲能力越強。本實驗獨立重復3次。

1.2.7 劃痕實驗檢測細胞的遷移能力 制備shNCMHCC97H和shSETDB2-MHCC97H細胞懸液，細胞計數(shù)后種植約5×105個細胞于6孔板中，培養(yǎng)過夜后細胞均勻成單層鋪滿于每孔中，用相同大小槍頭進行劃痕，每孔劃痕粗細均勻，PBS清洗劃下的細胞，添加不含血清的培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下于劃痕后0 h和24 h拍照，測量劃痕的寬度，計算細胞愈合率。實驗獨立重復3次。愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度，愈合率越高表示細胞的遷移能力越強。

1.2.8 基因芯片實驗 取1×107個shNC-MHCC97H和shSETDB2-MHCC97H細胞，用Trizol將細胞裂解后送樣至上?？党缮锕こ逃邢薰拘修D錄組測序，在2組細胞中測序結果有差異的基因制作成熱圖。

1.2.9 染色質免疫共沉淀（CHIP） 取對數(shù)生長期的1×108個shNC-MHCC97H和shSETDB2-MHCC97H細胞，以IgG和H3K9me3做免疫共沉淀，按照SimpleChIP?Enzymatic Chromatin IP Kit（Magnetic Beads）的操作步驟進行實驗，所得染色質用針對PTEN啟動子區(qū)域DNA序列的引物進行Realtime PCR定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用方差分析，組間多重比較用Tukey法，分類資料的統(tǒng)計分析采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織中SETDB2的蛋白及mRNA表達水平 Western blot結果顯示：在肝癌組織中SETDB2的蛋白表達高于癌旁組織；Real-time PCR的結果顯示：肝癌組織中SETDB2 mRNA的相對表達量高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。

2.2 SETDB2的表達與肝癌患者臨床病理特征的關系 SETDB2表達的高低與肝癌組織學分級和TNM分期有關，而與年齡及術前甲胎蛋白（AFP）水平無關，見表2。

Tab.1 The expression of SETDB2 in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues表1 SETDB2在肝癌及對應癌旁組織中的表達情況（n=37，±s）

Tab.1 The expression of SETDB2 in hepatocellular carcinoma and adjacent tissues表1 SETDB2在肝癌及對應癌旁組織中的表達情況（n=37，±s）

＊＊P＜0.01

組別癌旁肝癌t SETDB2蛋白表達量0.557±0.051 1.254±0.073 7.770＊＊SETDB2 mRNA表達量0.271±0.067 0.731±0.048 5.552＊＊

Tab.2 Relationship between SETDB2 expression and clinicopathological features表2 SETDB2的表達情況與肝癌臨床病理特征的關系

2.3 穩(wěn)定干擾SETDB2細胞的構建 Western blot檢測shNC組和shSETDB2組SETDB2的蛋白表達結果顯示，相比于shNC質粒，shSETDB2質粒可有效降低細胞中SETDB2的蛋白表達；熒光顯微鏡觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達情況顯示兩種質粒均已轉染入細胞并穩(wěn)定表達，見圖1。

2.4 降低SETDB2的表達導致肝癌細胞的侵襲遷移能力下降 Tanswell侵襲實驗結果顯示，shSETDB2-MHCC97H組細胞穿過小匙的數(shù)量少于shNCMHCC97H，差異有統(tǒng)計學意義，見圖2A、表3。而劃痕實驗結果表明，shSETDB2-MHCC97H細胞的愈合率低于shNC-MHCC97H細胞，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖2B、表3。

2.5 SETDB2上調PTEN的表達 基因芯片結果顯示，下調SETDB2的表達后，PTEN的mRNA表達水平升高，此外β-catenin及其下游某些靶基因如MMP-2、MMP-7、C-myc和CyclinD1表達下調，見圖3A。Western blot和Real-time PCR結果同樣顯示，下調SETDB2的表達導致PTEN的蛋白和mRNA表達增加，見圖3B、表4。

Fig.1 shSETDB2 plasmids can effectively reduce the expression of SETDB2 in MHCC97H cells圖1 shSETDB2質?？捎行Ы档蚆HCC97H細胞中SETDB2的表達

Fig.2 The invasion and migration capacity declined in shSETDB2-MHCC97H cells圖2 shSETDB2-MHCC97H細胞的侵襲和遷移能力下降

Tab.3 Results of Tanswell invasion assay and W oundhealing assay表3 Tanswell侵襲實驗和劃痕實驗結果 （n=3，±s）

Tab.3 Results of Tanswell invasion assay and W oundhealing assay表3 Tanswell侵襲實驗和劃痕實驗結果 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01

組別shNC-MHCC97H shSETDB2-MHCC97H t穿過小匙的細胞數(shù)量（個）103.700±4.410 43.330±3.756 10.420＊＊細胞的愈合率（%）50.8±4.9 23.0±3.6 4.542＊＊

Fig.3 Reduced SETDB2 up-regulated PTEN expression圖3 下調SETDB2導致PTEN表達上調

Tab.4 Expression levels of SETDB2 and PTEN m RNA表4 SETDB2與PTEN m RNA的表達量

2.6 shSETDB2導致PTEN基因的啟動子區(qū)域H3K9me3水平下調 Western blot結果顯示，下調SETDB2導致H3K9me3水平下降，見圖4。CHIP結果顯示，下調SETDB2后PTEN基因的啟動子區(qū)域的H3K9me3減少，見表5。

Fig.4 The reduced expression of SETDB2 down-regulated the level of trimethylation of H3K9圖4 降低SETDB2的表達使H3K9的三甲基化水平下調

Tab.5 The CHIP results of IgG and H 3K 9me3表5 IgG和H 3K 9me3 CHIP結果

2.7 PTEN是SETDB2調控肝癌細胞侵襲能力的關鍵因子 在穩(wěn)定敲低SETDB2表達的MHCC97H細胞中同時敲低PTEN的表達，應用Tanswell侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力發(fā)現(xiàn)：與敲低SETDB2組相比，在敲低SETDB2的同時敲低PTEN表達后，細胞的侵襲能力恢復，見圖5。

Fig.5 PTEN is a key factor for SETDB2 regulating the invasion ability of hepatoma cells圖5 PTEN是SETDB2調控肝癌細胞侵襲能力的關鍵因子

3 討論

組蛋白是組成核小體的核心部分，可以受多種共價修飾，如甲基化、乙酰化、磷酸化等；其中，組蛋白H3（Histone H3）的賴氨酸發(fā)生甲基化與基因轉錄的激活或者沉默密切相關［8］。一般來說，H3K9的三甲基化與基因轉錄抑制相關［9］。催化組蛋白發(fā)生甲基化的蛋白質叫甲基轉移酶，組蛋白賴氨酸甲基轉移酶通常都具有SET結構域。研究已經(jīng)表明，SETDB1（SET domain，bifurcated 1）具有催化 H3K9甲基化的作用［10］，且其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進作用也已經(jīng)有大量的文獻報道［11-13］。然而，SETDB1的同源蛋白SETDB2對腫瘤的作用仍不清楚，尤其是在肝癌中的表達情況及其作用，目前少有研究。本研究發(fā)現(xiàn)SETDB2基因在肝癌組織中的表達高于癌旁組織，且降低SETDB2表達可導致肝癌細胞的侵襲、遷移能力下降，雖然還缺少更多的樣本量驗證以及對SETDB2的表達與肝癌預后的風險進行評估，但是這些結果表明SETDB2可能促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。腫瘤的分型、分級和分期是目前評價腫瘤生物學行為和預后的最重要的三項指標，其中組織學分級是反映生物學行為和侵襲轉移能力的內在參數(shù)，腫瘤的TNM分期是反映腫瘤侵襲轉移能力的臨床可觀察參數(shù)。本研究分析SETDB2表達與肝癌臨床病理特征發(fā)現(xiàn)SETDB2與肝癌組織學分級和TNM分期有關。轉移和復發(fā)是導致肝癌患者死亡的主要原因，許多抗腫瘤藥物都是針對阻斷肝癌的轉移而發(fā)揮抗癌作用，最經(jīng)典的藥物就是索拉菲尼；但是索拉菲尼的有效率僅為20%左右［14］。仍然有大部分患者沒有特異的靶向藥物治療。本研究的結果表明SETDB2可以促進肝癌的侵襲和轉移，為肝癌的治療提供了一個新的靶向治療靶點。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多基因、多因素的過程，與癌基因激活、抑癌基因沉默有密切關系［15］。研究表明，抑癌基因PTEN在胰腺癌、肝癌等腫瘤中低表達并發(fā)揮抑癌作用［16-17］。然而，對PTEN表達的調控仍不是很清楚。本研究結果顯示SETDB2通過調控PTEN的表達進而影響肝癌的侵襲和轉移。此外，基因芯片結果還顯示敲低SETDB2不僅使PTEN上調，還會使β-catenin及其下游靶基因C-myc、CyclinD1等下調，這與PTEN可抑制Wnt/β-catenin信號通路的研究結論是一致的［18］。

雖然SETDB2蛋白包含有SET結構域，被定義為甲基轉移酶，但是仍少有證據(jù)表明SETDB2對H3K9me3的影響。本研究發(fā)現(xiàn)敲低SETDB2的表達使H3K9me3水平下降，應用CHIP實驗證明，在PTEN的啟動子區(qū)域的H3K9me3也是下降的。這些實驗結果說明SETDB2是通過組蛋白修飾從而抑制PTEN的表達。

在本研究中，通過檢測肝癌組織中SETDB2的表達以及體外細胞實驗證明SETDB2在肝癌中高表達并促進肝癌的侵襲轉移；此外，基因芯片和CHIP實驗結果證實甲基轉移酶SETDB2是通過影響PTEN的啟動子區(qū)域的H3K9me3水平進而抑制PTEN的表達，從而發(fā)揮促進肝癌侵襲轉移的作用，為肝癌的防治提供了一個新的靶點。