闞東陽,柯 學(xué),Walid Ghidan,肖素勤,肖 卿,胡向陽,孔祥祥,黃興奇,程在全

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650223；3.云南藍慮商貿(mào)有限公司，云南 會澤 650420)；4.中國科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

圖位克隆(Map-based cloning)也叫位點克隆，是基因克隆的經(jīng)典方法，1986年首先由劍橋大學(xué)的Alan coulson提出。它是通過已知位點的分子標記尋找目的基因并確定其物理圖譜位置，對基因進行粗定位和精細定位，最終克隆到目的基因的方法?；静襟E包括：篩選與目的基因緊密連鎖的分子標記, 目的基因的定位，構(gòu)建高質(zhì)量容易操作的大片段基因組文庫,目的基因的篩選和鑒定，相比其它基因克隆技術(shù)，圖位克隆結(jié)果更具可靠性[1-6]。

利用圖位克隆技術(shù)，已從擬南芥和其它多種植物發(fā)現(xiàn)了許多功能基因。擬南芥中，克隆到ω-脂肪酸去飽和酶基因[6]，發(fā)現(xiàn)IEN2基因編碼延伸因子復(fù)合物，參與NAD+介導(dǎo)的信號途徑[5]，與測序技術(shù)相結(jié)合發(fā)現(xiàn)種子油成分控制基因，克隆了葉綠素?zé)晒釲CF3基因[2]和葉形態(tài)建成基因ABL1。大豆中，克隆出開花相關(guān)基因GmGIa[7]和豆莢籽粒數(shù)相關(guān)主效基因Ln[8]。水稻中利用InDel和SNP引物精細定位到卷葉基因和抗除草劑基因[9-10]。黃瓜中利用2 971個F2植株將葉綠體發(fā)育和葉綠素代謝相關(guān)w基因定位于33 kb，利用9497個F2植株定位在8.2 kb[11]。黑麥草中利用圖位克隆精細定位了自交不親和基因座[12]白菜中利用圖位克隆首次發(fā)現(xiàn)了種皮顏色基因TTG1[13]。

【研究意義】擬南芥(Arabidopsisthaliana)由于其植株小、形態(tài)特征簡單、生活周期短、基因組小(125 Mb、2n=10、25000個蛋白編碼基因)，在遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)中是模式植物[14]。有Landsberg erecta (Ler)、Columbia (Col)和Wassilewskija (Ws)3種生態(tài)型，用于自交系構(gòu)建[4]，是突變體篩選、基因克隆和功能驗證的強有力工具[1]。在擬南芥圖位克隆初始工作中，面對數(shù)千個分子標記，常常讓研究者一籌莫展，需要一一篩選易用性分子標記用于初定位。因此篩選出了一批高效的分子標記，實現(xiàn)了擬南芥中目標基因的快速初定位，可以幫助其他研究者實現(xiàn)擬南芥中目標基因的快速定位?！厩叭搜芯窟M展】隨著測序技術(shù)的發(fā)展和多種植物基因組測序的完成，后基因組的時代到來，開發(fā)出了更多的分子標記(RFLP、RAPD、AFLP、INDEL、CAPS、SSR、SNP)，使圖位克隆的便利性和效率大為提高。在擬南芥中，已建立了TAIR(http://www.arabidopsis.org/marker)和AMP(http://amp.genomics.org.cn/)等數(shù)據(jù)平臺，在大量數(shù)據(jù)和信息的支持下，最快甚至幾個月就能證實和克隆到新基因[9,15]。即便如此，面對數(shù)千個分子標記，研究者也需要花費大量時間去篩選合適的分子標記?！颈狙芯壳腥朦c】通過已篩選出一批經(jīng)反復(fù)驗證過的高效的分子標記，實現(xiàn)了擬南芥中各條染色體上目標基因的快速初定位。【擬解決的關(guān)鍵問題】為解決擬南芥各條染色體上的目標基因的快速定位提供了一批高效的分子標記。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)Columbia生態(tài)型(Col)和Landsberg生態(tài)型(Ler)，以及二者雜交后代種子經(jīng)10 mmol/LEMS誘變后，播種篩選出的鹽敏感突變體S28株系。鹽敏感突變體種子播于MS培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)篩選，成苗后移栽入有機質(zhì)盒中于溫室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為23 ℃，16 h光照，8 h黑暗。

1.2 DNA提取

取擬南芥鮮葉1張，利用生工“Dzup基因組DNA快速抽提試劑盒”提取基因組DNA，提取方法參照產(chǎn)品說明書。

1.3 分子標記的選擇

從擬芥數(shù)據(jù)庫The Arabidopsis Information Resource (TAIR)(http://www.arabidopsis.org/)，和Arabidopsis mapping platform(AMP)(http://amp.genomics.org.cn/)上選擇44對分子標記，合成引物進行PCR檢測，對Columbia(Col)和Landsberg(Ler)進行分型，從中篩選出易用高效的分子標記。

1.4 PCR擴增及電泳檢測

根據(jù)引物合成信息，摸索PCR擴增及電泳檢測條件。實驗按常規(guī)進行，電泳檢測時瓊脂糖凝膠濃度為2 %。

1.5 重組率統(tǒng)計

對篩選出的24個分子標記的PCR擴增產(chǎn)物進行χ2檢測，確定其分離比是否符合孟德爾分離定律(即C∶H∶L=1∶2∶1)，計算重組率[重組率(%)=重組配子數(shù)/配子數(shù)×100]，對目標基因的初定位范圍進行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 從44個分子標記中篩選出24個平均分布于5條染色體的分子標記用于初定位

進行圖位克隆，分子標記的篩選非常重要。有些分子標記特異性不好，檢測條件苛刻，在實驗中難于利用，大大降低了克隆基因的效率。因此，應(yīng)選擇易用、高效的分子標記。

經(jīng)過反復(fù)驗證，從原先選擇出的44個分子標記中，篩選出24個分子標記，這24個分子標記平均分布于擬南芥的5條染色體上(圖1)，既有靠近著絲粒的標記(1號染色體的1-AC006228-4425、3號染色體的3-AP002062-5445、5號染色體的PHYC)，又有靠近端粒位置的標記(如1號染色體的1-AC007592-0663、2號染色體的Ciw2、3號染色體的3-AL356014-9336、4號染色體的4-AF069442-0706、5號染色體的5-AB009053-9339)。

合成引物(表1)，對24個標記的PCR的擴增反應(yīng)條件可分為5組進行(1個標記46 ℃退火，延伸20 min；8個標記48 ℃退火，延伸20 min；9個標記50 ℃退火，延伸20 min； 4個標記52 ℃退火，延伸30 min；2個標記56 ℃退火，延伸30 min)，110 V條件下，PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間有7種(40、50、60、70、80、100和140 min，表2)。在上述條件下，這24個分子標記易于擴增，條帶清晰，分辨率好，大大提高了多態(tài)性的判斷，是用于初定位的理想標記(圖2)。

圖1 24個分子標記在擬南芥染色體位置上的分布Fig.1 Distribution of 24 markers on chromosomes of Arabidopsis thaliana

表1 24個分子標記及PCR引物信息

表2 PCR擴增及電泳檢測條件

2.2 篩選出的分子標記在擬南芥耐鹽突變體中實現(xiàn)基因快速初定位

利用擬南芥構(gòu)建雜交群體，或?qū)σ吧秃吞囟ㄖ晗颠M行化學(xué)誘變或中子轟擊獲得突變體，根據(jù)表型定位克隆其中的突變基因，是通用擬南芥遺傳分析策略。通過Columbia和Landsberg生態(tài)型雜交獲得雜交后，對后代材料進行EMS誘變，從中挑選鹽敏感突變體，經(jīng)過至少2代篩選得到表型遺傳穩(wěn)定的突變材料，用于定位和克隆基因。

從EMS誘變材料中篩選到一株鹽敏感突變體S28，在MS平板上表現(xiàn)為根生長受抑制，根長極短(圖3)。經(jīng)平板和光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)成苗后，移栽到溫室培養(yǎng)，收種后進行播種用作初定位群體。在實驗中，利用篩選出的分子標記，完成了50個植株的多態(tài)性分析，檢測結(jié)果清晰明了(圖4)。

目標基因在圖位克隆中是根據(jù)分子標記與基因連鎖關(guān)系的緊密程度得到定位的。根據(jù)電泳結(jié)果，對24個標記的在S28群體中的帶型是否符合孟德爾分離定律(即C∶H∶L=1∶2∶1)進行χ2檢驗計算P值(以5 %為標準，大于5 %說明差異不顯著，小于5 %說明差異顯著)。

通過計算得到5號染色體上的引起的變異最顯著，相比其它染色體最不符合孟德爾分離定律，說明5號染色體上分子標記與目標基因存在連鎖現(xiàn)象。進一步統(tǒng)計5號染色體上所選分子標記的重組率[重組率(%)=重組配子數(shù)/配子數(shù)×100]，標記5-AB010070-0918、5-AL163792-1729、PHYC、K6M13和5-AB009053-9339的重組率分別為6 %、2 %、5 %、6 %和12 %。由此判定目標基因應(yīng)位于小于5 %的2個遺傳標記之間，即5-AL163792-1729與PHYC之間，并且靠近5-AL163792-1729的一端(表3)。

C代表Col,H代表雜合，L代表LerC: Col type; H: Heterozygote; L: Ler type圖2 24個分子標記的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Gel detection of PCR products of 24 markers

3 討 論

圖位克隆初定位是利用分子標記把目的基因定位到染色體的一段區(qū)域的過程。擬南芥由于基因組小，染色體少，給初定位帶來了便利。本研究建立的初定位系統(tǒng)，能利用24個分子標記，僅50株作圖群體就實現(xiàn)了目的基因的染色體初定位，整個初定位實驗?zāi)茉?周內(nèi)完成。這與Austin等強調(diào)的考慮到群體中基因分離重組的概率，至少要50個F2代個體才能觀察到可變分離的結(jié)論相符[16]，但完成整個圖位克隆所需的作圖群體通常應(yīng)大于1000個，特別是精細定位階段需要大樣本量。在擬南芥中，作圖距離每縮小10倍，作圖群體要增加2000個，才能保證目的基因位置判斷的準確性。Lei等利用2650個不育株，對擬南芥雄性不育基因BnMs2進行了精細定位[17]，在做精細定位和克隆時，有時往往也需要構(gòu)建BAC庫[18]，因此，工作量是很大的。對于本實驗中，根據(jù)遺傳分離規(guī)律，將目的基因初定位于5號染色體上的區(qū)域，下一步應(yīng)利用5-AL163792-1729與PHYC之間的更多分子標記，加大樣本量，逐步縮小區(qū)間。

圖3 鹽敏感突變體S28的表型Fig.3 Phenotype of salt sensitive lines S28

圖4 分子標記3-AP002062-5445在50個S28樣本中的檢測結(jié)果Fig.4 Gel image of PCR product for marker 3-AP002062-5445 in 50 samples of S28

分子標記MarkersC∶H∶L分子標記MarkersC∶H∶L1-AC007592-066312∶27∶11Ciw1112∶27∶11F21M1210∶26∶143-AP002062-544517∶24∶091-AC006228-442510∶29∶113-AL356014-933616∶24∶101-AC009324-661313∶25∶124-AF069442-070614∶21∶151-AC010675-864514∶21∶154-AL035526-553613∶23∶14Ciw214∶23∶134-AL079350-698512∶22∶15Ciw310∶28∶124-AL031394-871911∶27∶122-AC007232-478013∶29∶085-AB010070-091822∶22∶06Nga112614∶24∶125-AL163792-172943∶05∶022-AC004681-70218∶33∶09PHYC32∶13∶053-AB024034-181913∶26∶11K6M1316∶28∶063-AB022217-240210∶31∶095-AB009053-933914∶24∶12

圖位克隆是基因克隆的經(jīng)典方法之一，在植物基因發(fā)掘中得到廣泛運用，但其支撐點是眾多的分子標記。利用T-DNA及轉(zhuǎn)座子已獲得了20萬以上的擬南芥插入突變體，有5萬多個遺傳標記可選[19]。水稻中已開發(fā)了1萬多個分子標記，有EST(expressed sequence tags)、RFLPs(restriction fragment length polymorphism)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、RAPD(random amplified polymorphic DNA)、SSR(simple sequence repeat)和SNP(single nucleotide polymorphism)[13,20]。本研究中篩選出的24個分子標記，對于目的基因在擬南芥染色體上的快速初定位十分有效，但在精細定位中，可能會面臨從數(shù)據(jù)庫無標記可選，需要重新設(shè)計分子標記如INDEL標記。這在有完整基因組數(shù)據(jù)的擬南芥中相對來說是容易的，但是在遇到基因組背景序列不清楚的物種，或者由于育性難于擴大群體的突變材料時，應(yīng)利用測序技術(shù)與表型數(shù)據(jù)相結(jié)合，開發(fā)新的標記，如SNP標記、SCOT標記，以及新的單位點特異性PCR標記(如SCAR、CAPS、dCAPS)等，以實現(xiàn)目的基因的最終精細定位和克隆。

4 結(jié) 論

本研究中篩選出的24個分子標記，對于目的基因在擬南芥染色體上的快速初定位十分有效，讓檢測工作快速集中到染色體上的某一區(qū)域。利用這些標記，建立了擬南芥初定位快速圖位克隆系統(tǒng)，大大提高了初定位的效率，并實現(xiàn)擬南芥鹽敏感突變體S28的快速染色體初定位。