劉卜瑋，楊 雪，2，毛旭東，梁小虎，鄭天豪，何洪炳，賴松家 *

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130; 2. 成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川 成都 611130)

【研究意義】高等動(dòng)物中，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(skeletal muscle satellite cells，SMSCs)附著在肌纖維的底膜上，正常情況下是靜止的單核細(xì)胞，當(dāng)肌肉受到損傷后，能通過增殖和分化與原有的肌纖維融合形成新的肌纖維，對(duì)肌肉進(jìn)行修復(fù)。SMSCs的增殖和分化受復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)多重調(diào)控，例如成肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族的成肌分化因子D(MyoD)、MyoG、Myf4、Myf5和Myf6；它們和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(MEF2)家族成員共同激活和肌肉特異性的基因轉(zhuǎn)錄，其中MyoG對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的作用尤為突出，是分化的關(guān)鍵調(diào)控因子[1-2]。

MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中長(zhǎng)度18～24 bp的一類短鏈非編碼RNA，通過與靶基因的3端UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，不完全靶向可抑制該mRNA發(fā)揮作用，完全靶向則會(huì)降解該mRNA，從而實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miRNAs在肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育過程中也起著重要作用，如miR-1，miR-133a和miR-206是橫紋肌特異的miRNAs，在成肌細(xì)胞增殖分化過程中，miR-1、miR-133a和miR-206表達(dá)量升高，miR-1通過靶向組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)從而促進(jìn)MEF2的表達(dá)，而MEF2又可以促進(jìn)miR-1的表達(dá)，形成一個(gè)正反饋環(huán)，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化和抑制成肌細(xì)胞的增殖[4]。而miR-133a和miR-206分別通過抑制血清應(yīng)答因子(SRFs)和成肌抑制素基因(myostatin)的表達(dá)促進(jìn)SMSCs增殖[5-6]。miR-222參與調(diào)控多種生物學(xué)過程，例如，在小鼠的心臟中過表達(dá)miR-222，可以通過激活mTOR信號(hào)通路抑制心肌的凋亡，同時(shí)抑制P27的表達(dá)從而誘導(dǎo)心臟心力衰竭[7]；在平滑肌中，miR-222可以通過靶向PTEN/Akt通路中的關(guān)鍵因子抑制血管平滑肌自噬[8]；miR-222能通過靶向P21和P27促進(jìn)氣管平滑肌的增殖[9-10]。此外，更多的研究主要集中在miR-222對(duì)腫瘤的調(diào)節(jié)作用，研究表明miR-222能夠促進(jìn)黑色素瘤[11]、宮頸癌[12]、結(jié)直腸癌[13]等腫瘤的增殖或轉(zhuǎn)移。有研究表明，在小鼠的成肌細(xì)胞系(C2C12細(xì)胞系)中，miR-222過表達(dá)可以促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖和抑制成肌細(xì)胞的分化[14]。然而，目前沒有研究報(bào)道m(xù)iR-222是否參與調(diào)控家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。

我國(guó)是養(yǎng)兔大國(guó)，也是兔肉出口大國(guó)。家兔是一種十分重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，它既可以食用，也可以作為工業(yè)原料、觀賞動(dòng)物、醫(yī)用模型等，因此家兔具有很大的研究?jī)r(jià)值?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)采用剛出生新西蘭兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，研究miR-222對(duì)SMSCs增殖的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】結(jié)果表明miR-222過表達(dá)促進(jìn)SMSCs的增殖，miR-222抑制表達(dá)抑制SMSCs的增殖。

1 材料與方法

1.1 組織的采集和RNA的提取

所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科研兔場(chǎng)提供，分別采集6只(公母各3只)84日齡新西蘭兔的心、肝、脾、肺、腎、回腸和腿肌(半腱肌)組織樣各1 g左右，迅速放入液氮中保存。將樣品在液氮中研磨后，用Trizol法(TaKaRa，寶生物)提取出各樣本的總RNA備用。

1.2 RNA的抽提與反轉(zhuǎn)錄

總RNA和miRNAs的純度采用OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm比值測(cè)定，其完整性通過1.5 %瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit 貨號(hào)：1604342A和Takara, PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraer 貨號(hào)AK4002)進(jìn)行miRNA和mRNA的反轉(zhuǎn)錄，得到各自的cDNA，保存于-20 ℃冰箱。

1.3 實(shí)時(shí)螢光定量PCR(RT-qPCR)

miR-222的定量用U6(microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒自帶)作為處理數(shù)據(jù)的內(nèi)參基因，miR-222引物序列5’-agctacatctggctactgggt-3’，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)孔；RT-qPCR定量程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，熔解曲線：95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。mRNAs的定量體系：5 μl SYBR green I，0.4 μl上游引物，0.4 μl下游引物3.2 μl的去RNA，1 μl cDNA。本試驗(yàn)所用引物均由成都擎科生物有限公司合成。

1.4 功能富集分析

使用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miRBase(http://www.mirbase.org/)和miRWalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/generetsys-self.html)對(duì)miR-222進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，選擇3個(gè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)交集作為miR-222潛在的靶基因，然后使用DAVID 6.8工具(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行靶基因功能富集分析。

1.5 原代細(xì)胞培養(yǎng)

新生1 d的新西蘭兔脫頸處死后，取后腿半腱肌放入PBS中，仔細(xì)去除肌肉上面筋膜等組織，將肌肉塊剪碎后放入0.1 %的膠原蛋白Ⅰ中37 ℃水浴消化2 h，每10 min搖晃混勻1次；離心后用胰蛋白酶消化10 min，用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(含10 % FBS，1 %雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基)(GM)終止消化并用40 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，將濾液1000 r/min離心5 min，再將細(xì)胞重懸接種在培養(yǎng)瓶中。

1.6 miR-222過表達(dá)和抑制表達(dá)效率檢測(cè)

miR-222 mimics、miR-222 NC、miR-222 inhibitor和inhibitor NC由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列如表1。

表1miR-222mimics、miR-222NC、miR-222inhibitor和inhibitorNC序列信息

Table 1 The sequence information of miR-222 mimics, miR-222 NC, miR-222 inhibitor and inhibitor

名稱序列miR-222 mimicssense: agcuacaucuggcuacuggguantisense: ccaguagccagauguagcuuumiR-222 NCsense: uucuccgaacgugucacguttantisense:acgugacacguucggagaattmiR-222 inhibitoracccaguagccagauguagcuinhibitor NCcaguacuuuuguguaguacaa

將SMSCs培養(yǎng)在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80 %左右時(shí)，根據(jù)lipo3000(Thermo，貨號(hào)：L3000015)說明書將miR-222 mimics(濃度：50 nM)、miR-222 NC(濃度：50 nM)、miR-222 inhibitor(濃度：100 nM)和inhibitor NC(濃度：100 nM)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組3個(gè)重復(fù)孔，24 h后換液，48 h后，提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和定量分析miR-222的表達(dá)量，確定過表達(dá)和抑制表達(dá)效率。

1.7 細(xì)胞增殖檢測(cè)

CCK-8增殖檢測(cè)：將SMSCs按照1×104個(gè)/孔的密度接種進(jìn)96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80 %左右，根據(jù)lipo3000說明書將miR-222 mimics(濃度：50 nM)、miR-222 NC(濃度：50 nM)、miR-222 inhibitor(濃度：100 nM)和inhibitor NC(濃度：100 nM)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組8個(gè)重復(fù)，24 h后換成100 μl GM培養(yǎng)基，之后每48 h換液；檢測(cè)轉(zhuǎn)染后第24、48、74、96和120小時(shí)的細(xì)胞增殖情況，簡(jiǎn)述如下，每個(gè)孔提前2 h加入10 μl CCK-8試劑(同仁，貨號(hào)ck04)放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 mm處測(cè)定出吸光度，重復(fù)3次。

EdU增殖檢測(cè)：按照CCK-8增殖檢測(cè)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行EdU增殖檢測(cè)；將培養(yǎng)基換成100 μl 50 μM 濃度的EdU(銳博生物，廣州)GM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，其他操作步驟按照說明書進(jìn)行。倒置螢光顯微鏡觀察并采集螢光圖片，每孔至少采集5組圖片。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔct分析定量數(shù)據(jù)，使用imageJ 1.50e軟件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和計(jì)算百分比，使用SPSS 22對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(S.E.M)表示，P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表述組間差異極顯著。

圖1 miR-222在新西蘭兔各組中表達(dá)量Fig.1 The expression of miR-222 in New Zealand rabbit different organizations

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-222在各組織中的表達(dá)譜

對(duì)心、肝、脾、肺、腎、腿肌和回腸中miR-222進(jìn)行了定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-222在肝臟中的表達(dá)量最高，回腸中表達(dá)量最低，在腿肌中中度表達(dá)。結(jié)果如圖1。

2.2 靶基因功能富集分析

使用TargetScan、miRBase和miRWalk 3個(gè)在線預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，由于這3個(gè)數(shù)據(jù)庫上家兔的基因組不全，選擇在分類學(xué)上相近的小鼠基因組作為miRNA—mRNAs預(yù)測(cè)，篩選出了908個(gè)靶基因(3個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果取交集)，使用DAVID 6.8對(duì)靶基因進(jìn)行GO聚類分析和KEGG通路分析。這些靶基因參與轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和遷移等生物學(xué)過程，參與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、神經(jīng)元投射，細(xì)胞核等細(xì)胞構(gòu)成，參與蛋白質(zhì)結(jié)合、金屬離子結(jié)合、DNA結(jié)合、核苷酸結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄因子激活和激酶激活等分子功能(圖2)。此外，miR-222的靶基因富集在以下幾個(gè)通路，包括癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、人類嗜T細(xì)胞病毒Ⅰ型感染、Ras信號(hào)通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路和CAMP信號(hào)通路(表2)，這些數(shù)據(jù)表明，miR-222在生物體內(nèi)可能調(diào)控多種生物學(xué)功能。

圖2 GO分析預(yù)測(cè)miR-222的生物學(xué)功能Fig.2 Analysis of miR-222 biological function by GO terms

通路名稱相關(guān)基因P-ValuePathways in cancerE2F3, ADCY1, GNAI3, GNAI2, ADCY7, XIAP, LPAR2, GNG12, KIT, CXCL12, FOS, KRAS, CASP9, RASGRP1, GNG2, RUNX1, AXIN2, COL4A3, RET, BRAF, TGFBR1, RUNX1T1, SKP2, RAF1, IGF1, MAPK10, FZD5, STAT1, KITL, MAPK1, CBLB, 4930544G11RIK, MAPK90.0000PI3K-Akt signaling pathwayOSMR, LPAR2, GNG12, KIT, ITGB3, CDC37, KRAS, CASP9, GNG2, PRKAA2, MLST8, GHR, COL4A3, PKN2, YWHAB, IGF1, RAF1, KITL, IRS1, BCL2L11, MAPK1, YWHAG, CC-ND2, CHRM1, TSC2, RELN, PPP2R3C, EIF4E20.0005MAPK signaling pathwayPTPN7, CACNA2D1, NTF3, BRAF, TAOK1, TGFBR1, MAP2K4, PPP3R1, RAF1, MAPK10, CACNB4, GNG12, MAP3K7, FOS, MAPK1, KRAS, PAK2, MAP3K2, RASGRP1, MAPK9, ST-MN1, MAP3K13, NFATC30.0003HTLV-I infectionCRTC3, ADCY1, E2F3, XIAP, ADCY7, CRTC1, TGFBR1, MAP2K4, PPP3R1, NFYB, FZD5, CANX, ATF1, FOS, POLE4, KRAS, CCND2, ETS1, XBP1, ETS2, TRP53INP1, NFATC30.0024Ras signaling pathwayIGF1, RAF1, KIT, GNG12, MAPK10, KITL, RGL1, MAPK1, KRAS, PAK2, GAB2, TIAM1, ETS1, RASGRP1, ETS2, 4930544G11RIK, MAPK9, GNG2, RASA30.0032Oxytocin signaling pathwayADCY1, CACNA2D1, GNAI3, ADCY7, GNAI2, PPP3R1, RAF1, CACNB4, FOS, MAPK1, KRAS, CAMK4, 4930544G11RIK, GUCY1A3, CAMK2B, PRKAA2, NFATC3, CAMK1D0.0097Chemokine signaling pathwayADCY1, GNAI3, BRAF, ADCY7, GNAI2, PREX1, RAF1, GNG12, STAT1, CXCL12, CCL6, MAPK1, KRAS, TIAM1, 4930544G11RIK, CX3CR1, GNG2, WASL0.027cAMP signaling pathwayADCY1, GNAI3, BRAF, ADCY7, GNAI2, RAF1, ATP1A1, GRIA4, MAPK10, FOS, MAPK1, CAMK4, TIAM1, CHRM1, 4930544G11RIK, MAPK9, CAMK2B0.041

2.3 過表達(dá)和抑制表達(dá)效率

用miR-222、miR-222 mimics、miR-222 inhibitor和inhibitor NC分別轉(zhuǎn)染SMSCs，48 h后，監(jiān)測(cè)miR-222的表達(dá)量。過表達(dá)miR-222后，miR-222表達(dá)量升高了610倍，mimics組極顯著高于mimics NC組(圖3,P<0.01)；抑制表達(dá)miR-222后，表達(dá)量降低到約55 %，inhibitor組顯著低于inhibitor NC組(圖3,P<0.05)。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-222和抑制表達(dá)miR-222實(shí)驗(yàn)成功。

2.4 miR-222促進(jìn)SMSCs增殖

用CCK8試劑盒檢測(cè)SMSCs在24、48、72、96和120 h時(shí)的增殖情況。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-222后，在72、96和120 h時(shí)，mimic組的增殖速度顯著高于mimic NC組(圖4A，P≤0.05)。同時(shí)，miR-222 inhibitor組在72、96和120 h的增殖速度顯著低于NC組，如圖4B。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-222可以促進(jìn)家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，抑制表達(dá)miR-222可以抑制家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。

*P≤0.05,**P<0.01，下同*P≤0.05,**P<0.01, the same as below圖3 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)Fig.3 Detection of transfection efficiency

EdU試驗(yàn)結(jié)果表明miR-222能促進(jìn)SMSCs增殖，與miR-222 NC組相比，miR-222 mimics組EdU陽性細(xì)胞數(shù)量多36.4 %(P=0.008)；與inhibitor NC組相比，inhibitor組EdU陽性細(xì)胞數(shù)量少了19.4 %(P=0.037)。

3 討 論

本試驗(yàn)先分析了miR-222在新西蘭兔各個(gè)組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-222在肝臟中表達(dá)量最高，在腿肌中中度表達(dá)。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了miR-222的靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG pathway分析來推測(cè)miR-222的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集在轉(zhuǎn)錄因子激活、激酶激活、核苷酸結(jié)合等分子功能，細(xì)胞遷移、發(fā)育和凋亡等生物學(xué)過程，癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK、Ras、cAMP等信號(hào)通路，這些通路對(duì)肌肉的發(fā)育起著重要的調(diào)控作用，例如：PI3K-Akt通路可以抑制肌肉特異性的泛素連接酶MuRF1和MAFbx的表達(dá)從而抑制肌肉萎縮[15]，此外，比如胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor I，IGF-1)必須通過PI3K-Akt的磷酸化才能促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖[16]；而MAPK信號(hào)通路可以通過Myf5誘導(dǎo)胚胎早期祖細(xì)胞的成肌分化，激活MyoD和MEF2家族中的成肌轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化[17]。而且，miR-222在人類肌營(yíng)養(yǎng)不良疾病以及MDX肌營(yíng)養(yǎng)不良鼠模型的肌肉組織中的表達(dá)量都會(huì)升高[18-19]，這些都暗示著miR-222可能對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖有調(diào)控作用。

圖4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-222對(duì)SMSCs增殖的影響Fig.4 The effect of miR-222 on the proliferation of SMSCs cells via CCK-8 assay

細(xì)胞核被hoechst標(biāo)記成藍(lán)色，增殖的細(xì)胞被EdU標(biāo)記成紅色，Merge為兩種染色疊加，EdU陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)算公式為：(EdU陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞核數(shù)量)×100 %，比例尺為200 μmCell nuclei (blue) and EdU positive cells(red). The ratio of EdU-positive cells was calculated with (EdU-positive cells/Hoechst stained cells)×100 %. The scale bars stand 200 μm圖5 EdU試驗(yàn)檢測(cè)miR-222對(duì)SMSCs增殖的影響Fig.5 The effect of miR-222 on the proliferation of SMSCs cells via EdU assay

使用miR-222 mimics、miR-222 inhibotor分別對(duì)SMSCs進(jìn)行miR-222過表達(dá)和抑制內(nèi)源性miR-222表達(dá)，CCK-8增殖檢測(cè)和EdU增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，miR-222對(duì)SMSCs的增殖有促進(jìn)作用。miR-222在骨骼肌中的研究較少，Cardinali等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-222可以促進(jìn)C2C12小鼠成肌細(xì)胞的增殖，與本研究結(jié)果一致。在外周動(dòng)脈缺血后，miR-222能夠通過超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase‐2，SOD-2)抑制P57的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，從而促進(jìn)四肢骨骼肌的再生[20]。在心肌細(xì)胞中，miR-222也能促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖，在小鼠心臟內(nèi)對(duì)miR-222的表達(dá)進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)增殖的標(biāo)記基因(HIPK1和HMBOX1)表達(dá)量降低，心肌細(xì)胞和心臟的增殖發(fā)育受到阻礙[21]。在平滑肌中，miR-222靶向P27促進(jìn)哮喘病人氣管平滑肌的增殖。P27和P57是細(xì)胞周期抑制因子，通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDKs)的表達(dá)從而抑制G1-S、G2-M之間的轉(zhuǎn)換，引起細(xì)胞增殖受到抑制[10]，在骨骼肌中，P57和P27也可以同樣地抑制細(xì)胞的增殖，Chakkalakal等[22]研究發(fā)現(xiàn)，P27抑制小鼠骨骼肌的增重，敲出P27的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞損傷后的自我更新。Naito等[23]研究發(fā)現(xiàn)用RNAi技術(shù)抑制P57的表達(dá)，導(dǎo)致PAX7的表達(dá)量增加，從而促進(jìn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，miR-222在新西蘭兔各組織中差異表達(dá)，在肝臟中表達(dá)量最高，回腸中表達(dá)量最低，在肌肉中中度表達(dá)；用miR-222 mimics和inhibitor模擬miR-222在SMSCs中過表達(dá)和抑制表達(dá)，結(jié)果表明，miR-222對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。