辛華 謝晚晴 蔣寧 孫麗 鄭洪新

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，簡稱OP)，是指低骨量和骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞，以骨的脆性增加和易發(fā)骨折為主要特征的全身性、代謝性骨骼疾病[1]。OP主要包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性或退行性骨質(zhì)疏松癥，主要臨床表現(xiàn)為全身骨痛，其中腰背部疼痛是最常見癥狀，以及身長縮短、駝背、骨折等，有時可無明顯癥狀。隨著我國人均壽命的延長和人口老齡化的加重，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，已成為老年人的常見病和多發(fā)病[2]?，F(xiàn)代病因?qū)W認(rèn)為，OP與激素調(diào)控、營養(yǎng)狀態(tài)、物理因素、免疫狀況及遺傳等因素有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)典籍中無“骨質(zhì)疏松”這一病名，根據(jù)病因病機(jī)和臨床表現(xiàn)可將其歸于“骨枯”“骨極”“骨痿”“骨痹”和“骨蝕”等范疇，其中定性定位較準(zhǔn)確的當(dāng)屬“骨痿”[3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精，主骨生髓，腎精充足，則骨髓的生化有源，骨骼才能得到骨髓的充分滋養(yǎng)而堅固有力；若腎精虧虛，骨髓化源不足，不能濡養(yǎng)骨骼，便會出現(xiàn)骨骼脆弱乏力，引發(fā)骨質(zhì)疏松。OP病位雖在骨，但與腎密切相關(guān)。腎為先天之本，藏先后天之精氣，寓元陰元陽。人之生長壯老取決于腎中精氣之盛衰變化，而骨骼功能正常亦有賴于腎精充盈、骨髓生化有源，因此，隨年齡增長人體步入衰老階段，腎精不足，OP發(fā)病率顯著增高?？梢?，腎精虧虛，髓少骨枯骨痿是本病的基本病機(jī)。國內(nèi)已有大量臨床研究表明，通過補(bǔ)腎法為主治療OP獲得明顯療效。

本研究采用人類全基因組表達(dá)譜芯片檢測腎精虧虛證OP患者基因表達(dá)譜，對比OP患者和同齡健康人組，篩查與OP相關(guān)的差異表達(dá)基因，探討“腎精虧虛”衰老病機(jī)的OP患者相關(guān)基因的信息學(xué)特征，進(jìn)一步為臨床“從腎論治”O(jiān)P提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

原發(fā)性骨質(zhì)疏松組(OP group)：從遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院和上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院門診腎精虧虛證原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者群中隨機(jī)選擇16例患者，男女各半，年齡60歲以上。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合OP的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南2011》。②符合腎精虧虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照國家標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)臨床診療術(shù)語》腎系證類腎精(氣)虧虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)。③年齡在60-75歲之間。④簽署知情同意書者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者。②同時患有其他疾病或合并癥，以及其它證候。③某些特征人群，如精神病患者、病情危篤或疾病的晚期患者。④患有心、肝、腎損害等器質(zhì)性疾病。

對照組(control group)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心隨機(jī)選擇健康狀態(tài)(軀體、心理及社會生活無異常，不吸煙，不飲酒，無飲食偏嗜)老年人24例，男女各半，年齡60歲以上。

1.2 實驗材料

PrimeViewTMHuman Gene Expression Array，Affymetrix公司生產(chǎn)；cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒，Ambion生產(chǎn)，LOT NO：#1792；First Stand cDNA Synthesis Kit，BioLabs公司生產(chǎn)，LOT NO：E6560S；SYBR Green PCR Kit，QIAGEN生產(chǎn)，LOT NO：204143。

1.3 樣本采集

收集符合上述標(biāo)準(zhǔn)的OP組和對照組人群，清晨經(jīng)肘前靜脈采集5 mL血液，加入血液總RNA快速提取試劑(百泰克生產(chǎn))，混合均勻，-70 ℃保存。干冰冷凍，統(tǒng)一寄送北京博奧生物有限公司。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1基因芯片檢測及生物信息學(xué)分析：利用Affymetrix公司的PrimeViewTMHuman Gene Expression Array基因表達(dá)譜芯片，分析兩組基因差異表達(dá)。提取總RNA，并對總RNA進(jìn)行定量、質(zhì)檢。以總RNA為起始，進(jìn)行體外擴(kuò)增和生物素標(biāo)記，然后用于芯片雜交；使用AGCC軟件進(jìn)行芯片清洗和染色，然后掃描芯片；使用AGCC軟件對芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和歸一化處理(數(shù)據(jù)預(yù)處理采用RMA算法[4]進(jìn)行)。對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析：利用SAM(significance analysis of microarray)R程序包[5]分析差異基因，差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)是：q-value≤5%，且Fold Change≥1.5或≤0.5。對篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)一步進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能富集分析和Pathway分析。

1.4.2差異基因表達(dá)的驗證：Realtime-PCR 檢測差異表達(dá)基因mRNA 表達(dá)：利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計PCR引物，引物由上海生工公司合成。

從OP組及對照組分別隨機(jī)選取 10 例血液，提取總 RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測。逆轉(zhuǎn)錄按照BioLabs公司First Stand cDNA Synthesis Kit(E6560S)說明書操作，熒光定量按照 QIAGEN 的 SYBR Green PCR Kit(204143)說明書操作。PCR 反應(yīng)所用引物序列見表1，以 GAPDH 作為內(nèi)參。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 腎精虧虛證OP患者差異表達(dá)基因篩選

表2 上調(diào)差異基因表達(dá)倍數(shù)超過3倍的基因Table 2 Expression of up-regulated differential genes by 3 times

表3 下調(diào)差異基因表達(dá)倍數(shù)小于0.5倍的基因Table 3 Expression of down-regulated differential genes by 0.5 times

與同齡健康狀態(tài)老年人對照組比較，腎精虧虛證OP患者中特異性表達(dá)的探針有910個，對應(yīng)602個基因(FC≥1.5或FC≤0.667，q-value≤5%)，其中上調(diào)基因579個，下調(diào)基因23個(見圖1)，圖中紅點表示該基因在OP組中的表達(dá)明顯高于對照組(上調(diào))，綠點反映該基因在OP組的表達(dá)明顯低于對照組(下調(diào))。上調(diào)倍數(shù)超過3倍的基因有7個，分別為S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、LTF、ANXA3、IL1R2、PLSCR1(見表2)；下調(diào)倍數(shù)高于2倍的基因有3個，分別為CX3CR1、SPON2、GNLY(見表3)。

2.1.1腎精虧虛證OP患者差異表達(dá)基因(GO)功能注釋分析：對腎精虧虛證OP患者差異表達(dá)基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能注釋，GO分析可從生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)三個方面對差異表達(dá)基因涉及的功能進(jìn)行注釋、富集、聚類。

圖1 OP患者差異表達(dá)基因的散點圖Fig.1 The scatter chart of differential expressed genes

用DAVID對差異蛋白進(jìn)行GO富集分析顯示，涉及GO-BP功能的主要參與免疫應(yīng)答(10.6%)、防御應(yīng)答(10%)、編程性細(xì)胞死亡調(diào)控(9%)、受傷應(yīng)答(7.8%)、編程性細(xì)胞死亡(7.5%)、膜組織(5.3%)、炎癥應(yīng)答(5.3%)、細(xì)菌應(yīng)答(4.7%)、脂多糖應(yīng)答(2.5%)、細(xì)菌來源的分子應(yīng)答(2.5%)等過程；差異基因涉及GO-MF功能的以結(jié)合功能為主，酶結(jié)合(6%)、二聚體蛋白的活動(5.5%)、GTP結(jié)合(4%)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合(4%)、GTP酶活性(3.5%)、小結(jié)合蛋白連接酶活性(2.3%)、核酸結(jié)合(1.7%)、細(xì)胞因子受體活性(1.3%)。

2.1.2腎精虧虛證OP患者差異表達(dá)基因Pathway分析：KEGG Pathway分析顯示，這些差異表達(dá)基因主要屬于趨化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(3.8%)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(2.8%)、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移(2.7%)、造血細(xì)胞系(2.3%)、FcγR-介導(dǎo)吞噬(2.2%)、病毒性心肌炎(1.8%)、幽門螺桿菌感染的上皮細(xì)胞信號(1.5%)、同種異體移植排斥(1.2%)、移植物抗宿主疾病(1.2%)、1型糖尿病(1.2%)等。

2.2 腎精虧虛證OP患者差異表達(dá)基因的PCR驗證結(jié)果

針對上述差異基因表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增驗證，驗證結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果一致。與同齡健康狀態(tài)老年人比較，腎精虧虛證OP患者S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、ANXA3、IL1R2、PLSCR1基因的mRNA表達(dá)顯著增加，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖2。與同齡健康狀態(tài)老年人比較，腎精虧虛證OP患者CX3CR1、SPON2、GNLY基因的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖3。

圖2 腎精虧虛證OP組上調(diào)顯著的差異基因表達(dá)Fig.2 The expression of significant up-regulated genes in OP-KED group

圖3 腎精虧虛證OP組下調(diào)顯著的差異基因表達(dá)Fig.3 The expression of significant down-regulated genes in OP-KED group

3 討論

腎主骨、生髓的生理功能，實際上是腎之精氣具有促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育功能的一個重要組成部分。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎藏精，精生髓，髓藏于骨腔之中，髓養(yǎng)骨，促進(jìn)骨骼生長發(fā)育。如《素問·陰陽應(yīng)象大論》：“腎生骨髓”；《素問·平人氣象論》：“腎藏骨髓之氣”[6]。髓藏與骨腔之中，以充養(yǎng)骨骼，所謂“腎充則髓實，髓實則骨壯”，故稱“腎主骨”，見于《素問·宣明五氣》?！端貑枴ち?jié)藏象論》又稱：“腎者……其充在骨。”因此，腎-精-髓-骨組成一個系統(tǒng)，有其內(nèi)在聯(lián)系。腎精充足，髓化生有源，骨質(zhì)得養(yǎng)，則發(fā)育旺盛，骨質(zhì)致密，堅固有力。

反之，如腎精虧虛，骨髓化生無源，骨骼失其滋養(yǎng)。在小兒，就會骨骼發(fā)育不良或生長遲緩，骨軟無力，囟門遲閉等；在成人，則可見腰膝酸軟，步履蹣跚，甚則腳痿不能行動；在老年，則骨質(zhì)脆弱，易于骨折等[7]。如《素問·逆調(diào)論》：“腎不生則髓不能滿?！薄端貑枴ゐ粽摗罚骸澳I氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿?！?/p>

中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥具有較好的療效，尤其在改善臨床癥狀方面。據(jù)文獻(xiàn)報道，目前多數(shù)研究者認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥的根本原因為腎精虧虛，中醫(yī)藥治療多以補(bǔ)腎為主[8-12]。但是，其療效機(jī)制尚不清楚，發(fā)病機(jī)制也需要更加深入的研究。

本研究采用高通量基因芯片技術(shù)研究人類全基因組表達(dá)譜，探討原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者和同齡健康狀態(tài)老年人的差異基因表達(dá)。初步結(jié)果顯示：兩組人群血清中特異性表達(dá)的探針有910個，對應(yīng)602個基因(FC≥1.5，q-value≤5%)，其中上調(diào)基因579個，下調(diào)基因23個。上調(diào)倍數(shù)超過3倍的基因有7個，分別為S100P、SNX3、DEFA1、MMP9、ANXA3、IL1R2、PLSCR1；下調(diào)倍數(shù)小于0.5倍的基因有3個，分別為CX3CR1、SPON2、GNLY。對差異基因表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增驗證，結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果一致。

用DAVID對差異蛋白進(jìn)行GO富集分析以及 KEGG Pathway等進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示，差異基因表達(dá)主要涉及參與免疫、防御、受傷、炎癥、細(xì)菌、脂多糖等應(yīng)答，編程性細(xì)胞死亡及其調(diào)控等生物學(xué)過程；并與酶、GTP、鳥嘌呤核苷酸、GTP酶、核酸結(jié)合，二聚體蛋白的活動，小結(jié)合蛋白連接酶活性，細(xì)胞因子受體活性等分子功能，以及趨化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等有關(guān)。

其中，與原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制比較重要的差異基因表達(dá)：S100蛋白(S100P)家族，是多功能信號蛋白，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)鈣依賴性的細(xì)胞調(diào)節(jié)信號，在酶的活化、蛋白磷酸化、細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖分化、黏附運(yùn)動、細(xì)胞凋亡及維持細(xì)胞內(nèi)外Ca+平衡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[13,14]。研究表明，S100蛋白與成骨細(xì)胞分化及成骨性骨肉瘤侵襲轉(zhuǎn)移等方面有著密切關(guān)系[15]。可能參與調(diào)節(jié)骨形成或骨吸收[16]。袁赤亭的研究結(jié)果表明，S100蛋白在去勢大鼠股骨頭中的表達(dá)規(guī)律為術(shù)后2個月之內(nèi)處于高表達(dá)狀態(tài)；術(shù)后3個月與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；術(shù)后4-6月呈低表達(dá)[17]。由此可見，S100在骨質(zhì)疏松過程中發(fā)揮著重要的骨代謝調(diào)控作用。

分選連接蛋白3(sorting nexin 3，SNX3)是分選連接蛋白家族(sorting nexins)的重要成員之一，有多種生物學(xué)功能，其中最重要的是參與胞內(nèi)多種蛋白分子的轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)體的成熟與分選等[18]。

防御素(defensin，DEFA1)最早被認(rèn)為是一種殺菌肽，經(jīng)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，它不僅具有抗菌作用，而且還能抗真菌和病毒等多種微生物感染的作用，在機(jī)體非特異性以及獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用[19]。

基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是人體內(nèi)最重要的蛋白酶之一，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶超家族成員中明膠酶的一種，又稱明膠酶B，其主要功能是分解細(xì)胞外基質(zhì)，參與人體許多生理及病理過程。該因子在人體內(nèi)很多細(xì)胞中，包括在破骨細(xì)胞中都能表達(dá)，其表達(dá)又受到體內(nèi)眾多因子的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)等，其作用底物主要是Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原，明膠及彈性纖維[20]。研究表明，骨橋蛋白(OPN)激活NF-κB信號通路，上調(diào)MMP9蛋白及基因表達(dá)，調(diào)控成骨細(xì)胞破骨及細(xì)胞的增殖和分化能力[21-24]。

膜聯(lián)蛋白(annexin，ANX)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量較高，約占細(xì)胞總蛋白的1%-2%，是依賴鈣離子調(diào)控的酸性膜磷脂結(jié)合蛋白超家族。其家族包括A、B、C、D 和 E五類。據(jù)文獻(xiàn)報道，ANX家族蛋白參與了包括細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞吞與胞吐、分化與凋亡、炎性反應(yīng)調(diào)控及抗凝血反應(yīng)等一系列重要的細(xì)胞生理過程[25]。ANXA3是膜聯(lián)蛋白超家族的一員。

白細(xì)胞介素1受體2(IL1R2)作為誘餌受體，主要表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[26]。IL1R2是可以螯合IL-1β的誘餌分子，并阻斷下游信號傳導(dǎo)的起始，從而防止炎癥。IL1R2受體可使一些復(fù)雜疾病中的炎癥減輕，如強(qiáng)直性脊柱炎、關(guān)節(jié)炎等[27,28]。

磷脂爬行酶1(PLSCR1)是Ca2+結(jié)合的棕櫚?；蛐湍さ鞍?，棕櫚?；蠖ㄎ挥诩?xì)胞膜，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，同時PLSCR1還是多種激酶的底物[29]。

C-X3-C趨化因子受體1(CX3CR1)是fractalkine的唯一受體，二者的相互作用,可通過提高細(xì)胞黏附和促進(jìn)CX3CR1 陽性細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)移在組織損傷中發(fā)揮作用[30]。

脊椎蛋白2(SPON2)是脊椎蛋白(spondin)家族成員之一。研究表明，骨骼發(fā)育受Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控[31]，Wnt/β-catenin信號通路通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的發(fā)育、分化和激活OPG基因表達(dá)而調(diào)控骨骼的發(fā)育[32]。另有研究表明，spondin可激活并協(xié)同Wnt/β-catenin信號通路參與對細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控[33]。

顆粒溶素(granulysin，GNLY)是脂蛋白皂素樣蛋白家族的一員，與穿孔素和顆粒酶共同定位與人細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)的溶細(xì)胞顆粒上[34]。顆粒溶素具有溶細(xì)胞和殺菌的活性，其作用對象包括腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌、真菌和寄生蟲。隨著人們對顆粒溶素研究的深入，顆粒溶素的抗菌、抗腫瘤作用也越來越多的被人們所了解，其在超級細(xì)菌感染中起到重要免疫作用[35]。

綜上所述，腎精虧虛證OP患者的差異基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)顯著，提示免疫應(yīng)答、防御應(yīng)答、趨化因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中可能發(fā)揮著重要的作用。結(jié)合以往文獻(xiàn)報道，S100P家族的調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用；SNX3的參與胞內(nèi)多種蛋白分子的轉(zhuǎn)運(yùn)作用； DEFA1、CX3CR1及SPON2的調(diào)控免疫應(yīng)答作用；ANXA3、IL1R2、CX3CR1、GNLY介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)作用；SPON2激活并協(xié)同Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的發(fā)育、分化作用；MMP/TIMP動態(tài)平衡破壞等，均有可能在骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用。

本研究初步結(jié)果為后續(xù)關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制相關(guān)研究開拓思路，為腎精虧虛證骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)藥防治提供可能的作用靶點。根據(jù)本次差異基因篩查結(jié)果，后續(xù)我們將開展靶基因預(yù)測、針對靶基因信號調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。