田志革，李文楓，陳立新，畢洪文，黃峰華，吳立成

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站 哈爾濱 150086； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院信息中心 哈爾濱 150086；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院 哈爾濱 150069； 4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 哈爾濱 150086）

番茄是全球栽培最廣、消費(fèi)量最大的蔬菜作物，中國是世界最大的番茄生產(chǎn)和消費(fèi)國之一，番茄生產(chǎn)是農(nóng)民增收致富和出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)業(yè)，在我國的栽培面積逐年擴(kuò)大[1]。由于目前番茄大多采用溫室設(shè)施種植，而溫室內(nèi)的小氣候環(huán)境一般濕度較高，溫度也高于室外，容易滋生病害[2]。由半知菌亞門灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）引起的番茄灰霉病是一種世界性病害，又稱灰腐病、白點(diǎn)病，番茄感病后，發(fā)病部位會(huì)產(chǎn)生灰白色或灰褐色霉層，甚至爛苗、爛果，造成嚴(yán)重減產(chǎn)減收[3-4]；除能引起田間損失外，其在果實(shí)的貯存和運(yùn)輸中也造成嚴(yán)重危害，使得果實(shí)的貯存期變短、品質(zhì)變差，進(jìn)一步造成經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。

目前，在全國各番茄產(chǎn)區(qū)如遼寧[7]、江蘇[8-9]、山西[2]、江西[10]、浙江[11]、北京、吉林、湖南等地[12]均有番茄灰霉病病原菌分離、抗性菌株鑒定、新型殺菌劑應(yīng)用效果的研究報(bào)道。隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，黑龍江省設(shè)施番茄的種植面積逐年擴(kuò)大，而對(duì)番茄灰霉病菌的生物學(xué)特性、流行性及防治手段等的研究卻缺乏系統(tǒng)性及持續(xù)性[13-14]，這對(duì)準(zhǔn)確把握黑龍江省番茄灰霉病病情及有效防控十分不利。因此有必要對(duì)黑龍江省番茄灰霉病進(jìn)行持續(xù)關(guān)注，分析灰霉病菌的遺傳進(jìn)化規(guī)律，為控制番茄灰霉病的蔓延及有效防治提供參考依據(jù)。

筆者從黑龍江省齊齊哈爾市某溫室中采集疑似感染番茄灰霉病的病葉，采用組織分離法進(jìn)行病原菌的分離及生物學(xué)鑒定，以期為番茄灰霉病菌的生物學(xué)特性研究及其有效防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試疑似感染番茄灰霉病的番茄葉片采自齊齊哈爾市興十四村某番茄溫室，種植的番茄品種為‘禾?！?/p>

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉 20 g，去離子水1 000 mL，分裝后121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化 菌株的分離與純化參考方中達(dá)[15]的方法。在無菌環(huán)境下，將疑似感染番茄灰霉病菌的番茄病葉表面用蘸有75%的酒精棉球擦拭，在病健交界處取一小塊組織，10%Na-ClO溶液浸泡3 min后，無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸去多余水分，用無菌鑷子將組織塊放在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，28℃恒溫暗培養(yǎng)3 d后，從長(zhǎng)出的菌落邊緣挑取菌絲轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)皿中，按此方法轉(zhuǎn)接純化3次，獲得菌落形態(tài)一致的純培養(yǎng)物，4℃保存。

1.2.2 病原菌致病性測(cè)定 挑選完全展開、健康完整的番茄葉片，經(jīng)表面消毒后，用解剖針刺破表皮，形成傷口，打取直徑為5 mm的帶有菌絲的菌餅，倒置接種至番茄葉片的傷口處，放置在鋪有雙層濾紙（浸透無菌水）的平皿或保鮮盒內(nèi)，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照條件12 h/12 h（L/D），觀察葉片發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)5 d，待菌落長(zhǎng)至整皿的80%左右，觀察菌落的顏色、形狀。待菌絲產(chǎn)孢后，在顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子形態(tài)。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定 采用CTAB法提取病原菌基因組DNA。采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')以及 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。20 μL PCR 擴(kuò)增體系如下：2×Taq Master Mix 10 μL,10 μmol·L-1上下游引物各 1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)足至 20 μL。ITS 的 PCR 反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，測(cè)序所得序列在GenBank中進(jìn)行同源比對(duì)，利用Lasergene軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。引物的合成及測(cè)序均由吉林省庫美生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄灰霉病危害癥狀

番茄的莖、葉、花、果實(shí)均可感染灰霉病菌，致病果皮呈灰白色，軟腐，嚴(yán)重時(shí)果實(shí)脫落，葉片染病，多從葉尖開始，病斑呈“V”字形向內(nèi)擴(kuò)展，淺褐色，病斑表面可產(chǎn)生灰霉，葉片枯死，圖1為感染番茄灰霉病菌的葉片癥狀。

圖1 葉片感染番茄灰霉病菌的典型癥狀

2.2 病原菌分離純化及形態(tài)觀察

采用組織分離法在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行病原菌的分離純化。接種36 h后，可觀察到菌絲體生長(zhǎng)呈白色放射狀，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落顏色逐漸加深至灰色，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛（圖2-1），培養(yǎng)8 d后，菌落上形成球形或者不規(guī)則的菌核（圖2-2）。經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病原菌的分生孢子梗為淡褐色，呈不規(guī)則的樹狀分支，分支末端膨大，著生大量分生孢子（圖2-3）。分生孢子為單孢，呈卵圓形（圖2-4）。根據(jù)以上特征，初步判斷該病原菌為Botrytis cinerea，命名為 HLJ-05。

圖2 番茄灰霉病菌的形態(tài)觀察結(jié)果

圖3 番茄灰霉病菌對(duì)番茄葉片的致病性

2.3 病原菌致病性測(cè)定

由圖3可知，番茄接種HLJ-05菌餅3 d后，葉片生水漬狀病斑，淺褐色，邊緣不規(guī)則，具有深淺相間的輪紋，生出灰白色菌絲，符合番茄灰霉病初期發(fā)病癥狀，從病斑處重新挑取菌絲，鏡檢發(fā)現(xiàn)與HLJ-05菌絲形態(tài)一致。

2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

利用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)分離的病原菌ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期相符的539 bp的片段（圖4A）?；趓DNA-ITS序列，將分離的菌株與GenBank中下載的灰葡萄孢菌株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析（圖4B），結(jié)果表明，該菌株與已報(bào)道的Botrytis cinerea的序列相似性為100%，聚為一類，證實(shí)分離的病原菌為灰葡萄孢菌。

[注]M為DNA2 000 Marker；1為空白對(duì)照；2為待檢樣品。

圖4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

3 討論與結(jié)論

生產(chǎn)上，番茄灰霉病的防治仍以化學(xué)防治為主，輔以農(nóng)業(yè)防治、生物防治和生態(tài)防治等措施。中國各地陸續(xù)監(jiān)測(cè)了番茄灰霉病菌對(duì)當(dāng)?shù)爻Ｓ脷⒕鷦┑目顾幮郧闆r，以期對(duì)當(dāng)?shù)胤鸦颐共〉姆乐谓o予指導(dǎo)[16]，而抗藥性工作開展的基礎(chǔ)條件是病原菌的分離與鑒定，只有充分掌握本地區(qū)病原菌的流行情況，才能有的放矢地制定防治策略。筆者從黑龍江省齊齊哈爾市番茄種植區(qū)采集的番茄病葉中分離到的病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定，確定引起番茄灰霉病的病原菌為灰葡萄孢菌。后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步擴(kuò)大采樣范圍，并對(duì)黑龍江省番茄灰霉病菌的生物學(xué)特性、抗藥性進(jìn)行系統(tǒng)研究，為有效防治該病害提供參考依據(jù)。