亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        大黃素對低氧環(huán)境下SGC7901細胞HIF-1α和E-cadherin的影響*

        2018-10-18 11:23:18張秋菊李能蓮馬亞偉李亞玲
        中醫(yī)研究 2018年10期
        關鍵詞:培養(yǎng)箱黃素低氧

        張秋菊 ,李能蓮,馬亞偉,劉 靚,侯 茜,李亞玲

        (1.甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院,甘肅 蘭州 730000; 2.甘肅中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院 2013級臨床醫(yī)學專業(yè)B班, 甘肅 蘭州 730000)

        大黃是一味主要的破堅攻邪中藥,瀉下、破積、行瘀的功效強悍,因此被稱為“將軍”。惡性腫瘤大多有氣滯郁結(jié)、痰濕凝滯等病理因素,遷延日久而凝聚成腫塊。據(jù)“堅者削之,留者攻之,結(jié)者散之,客者除之”的治療原則,大黃常被作為攻邪藥來治療腫瘤,療效顯著。低氧是人體有形之瘤微環(huán)境的一個最顯著特點,絕大多數(shù)腫瘤細胞可耐受缺氧而存活,缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor,HIF-1α) 就是啟動這一過程的關鍵分子。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是上皮細胞連接中最主要的黏附分子,被認為是HIF-1α下游的靶基因。HIF-1α和E-cadherin可共同影響腫瘤細胞的增殖與遷移[1]。本研究通過大黃的有效成分大黃素(emodin)干預胃癌SGC7901細胞來探討大黃素在低氧環(huán)境中對腫瘤細胞增殖及HIF-1α和E-cadherin的影響。

        1 材料與方法

        1.1 細胞培養(yǎng)

        胃癌SGC7901細胞株由甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合實驗室饋贈。將SGC7901細胞株用加入體積分數(shù)100 mL/L的胎牛血清、質(zhì)量分數(shù)100 mg /L青、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng),放置于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱,常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期SGC7901細胞,經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為2.5 g/L的胰酶消化后,接種于細胞培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、10 mL/L O2、940 mL/L N2低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        1.2 試 劑

        大黃素(純度﹥98%)、MTT試劑盒、二甲基亞砜(DMSO),均購自北京索萊寶科技有限公司,批號依次為S90044,M8180,8370;鼠抗人E-cadherin單克隆抗體,購自北京中杉金橋生物有限公司,批號ZM-0092;鼠抗人HIF-1α多克隆抗體,購自于Immunoway公司,批號B3301。

        1.3 分組與處理

        實驗分空白對照組(含DMSO的培養(yǎng)基)和實驗組(大黃素分別為10,20,40,80,160 μmol/L),共6組。大黃素用DMSO溶解稀釋后,用體積分數(shù)100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液分別稀釋為10,20,40,80,160 μmol/L,待用。

        1.4 檢測指標

        1.4.1 胃癌SGC7901細胞增殖情況

        以 MTT法檢測大黃素對胃癌SGC7901細胞增殖的影響。取對數(shù)生長期SGC7901細胞,以培養(yǎng)液稀釋為終濃度為1×105/mL 的單細胞懸液,以每孔100 μL 加入96孔培養(yǎng)板中,置于37 ℃、10 mL/L O2、940 mL/L N2的低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后實驗組加入不同濃度的大黃素。每組設5個重復孔,繼續(xù)分別孵育12,24,36,48 h。實驗結(jié)束前4 h加入質(zhì)量分數(shù)為5 g/L的 MTT溶液20 μL ,振蕩后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),吸去上清,加入100 μL DMSO振蕩溶解10 min,空白對照調(diào)零,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490 nm波長下各孔OD值。計算細胞抑制率:抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

        1.4.2 E-cadherin和HIF-1α在胃癌SGC7901細胞中的表達

        免疫組化檢測E-cadherin和HIF-1α在細胞中的表達。蓋玻片泡酸、高壓滅菌后,平放于12孔培養(yǎng)板底部;取對數(shù)生長期胃癌SGC7901細胞,以培養(yǎng)液稀釋為終濃度為1×105/mL的單細胞懸液;每孔加入2 mL;置于37 ℃、10 mL/L O2、940 mL/L N2低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng);24 h細胞貼壁后,換液。根據(jù)MTT結(jié)果,選取大黃素10,40,80 μmol/L 3個梯度組,每組4個重復孔,設空白組,低氧孵育36 h。終止培養(yǎng),以100 g/L 多聚甲醛固定,常規(guī)免疫組織化學染色法分別標記E-cadherin和HIF-1α。結(jié)果判定:E-cadherin表達在細胞漿和細胞膜上,HIF-1α表達在細胞質(zhì)和細胞核上,呈棕黃色顆粒,在不同部位均一彌漫性分布。按染色強度[2]分為3級:淺黃色為(+),棕黃色為(++),棕褐色為(+++)。

        1.4.3 胃癌SGC7901細胞形態(tài)變化

        倒置顯微鏡下,不同倍數(shù)各取5個視野,觀察大黃素對SGC7901細胞形態(tài)的影響。

        1.5 統(tǒng)計學方法

        2 結(jié) 果

        2.1 不同時間、不同濃度大黃素對胃癌SGC7901細胞增殖的影響

        MTT結(jié)果顯示:大黃素可明顯抑制低氧環(huán)境中SGC7901細胞的增殖,抑制率與濃度、時間呈成正相關。見表1和圖1。

        表1 不同時間、不同濃度大黃素對胃癌SGC7901細胞的影響

        組別12 h24 h36 h48 h空白組0.058 6±0.017 00.058 4±0.013 90.074 4±0.032 40.061 2±0.017 9大黃素10 μmol·L-1組0.436 0±0.057 40.433 6±0.017 70.482 6±0.068 20.495 2±0.035 6大黃素20 μmol·L-1組0.362 2±0.066 50.362 2±0.045 20.406 8±0.055 20.432 8±0.013 7大黃素40 μmol·L-1組0.321 4±0.024 10.308 6±0.046 50.324 8±0.037 80.268 4±0.041 1大黃素80 μmol·L-1組0.275 4±0.036 80.236 8±0.031 00.233 4±0.041 60.214 8±0.057 3大黃素160 μmol·L-1組0.241 4±0.023 30.177 6±0.026 20.186 8±0.024 50.145 2±0.033 5

        圖1 胃癌SGC7901細胞抑制率與大黃素濃度、時間的關系

        2.2 不同濃度大黃素對胃癌SGC7901細胞形態(tài)的影響

        倒置顯微鏡觀察不同濃度大黃素作用36 h后SGC7901細胞數(shù)目和形態(tài)的變化。SGC7901細胞隨著大黃素濃度的增加,細胞數(shù)目明顯不斷減少;細胞形態(tài)由原來的多邊形逐漸變成小圓形;細胞與細胞之間的距離增大,連接消失,但細胞表面的突起逐漸變得粗大、延長。當大黃素濃度達到160 μmol/L時,絕大多數(shù)細胞變圓變亮,懸浮死亡。見圖2。

        黑色箭頭所示為細胞間連接,白色箭頭所示為細胞突觸圖2 不同濃度大黃素干預36 h后的SGC7901細胞(×40)

        2.3 不同濃度大黃素對SGC7901細胞中E-cadherin和HIF-1α表達的影響

        E-cadherin和HIF-1α在SGC7901細胞中呈現(xiàn)不同的表達強度,應用Spearman等級相關分析發(fā)現(xiàn):E-cadherin的表達與大黃素的濃度呈正相關(r=0.816,P=0.001<0.05),而HIF-1α的表達與大黃素的濃度呈負相關(r=-0.646,P=0.023<0.05)。見圖3和表2。

        圖3 大黃素濃度為80 μmol/L時,HIF-1α

        組別nHIF-1α++++++E-cadherin++++++大黃素20 μmol·L-1組4112040大黃素40 μmol·L-1組4031022大黃素80 μmol·L-1組4400004

        3 討 論

        大黃素的化學名稱為 1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌,是中藥大黃的有效成分,也是分布最廣泛的一種蒽醌類物質(zhì)。近年來研究發(fā)現(xiàn),大黃素有明顯的抗腫瘤作用,但是作用機制仍有爭議[3]。HIF-1α是缺氧誘導因子的最主要亞型,與腫瘤細胞的能量代謝、血管生成、細胞增殖和凋亡等有密切關系。目前,HIF-1α被認為是腫瘤治療的潛在靶點,相應的藥物已經(jīng)進入臨床試驗階段。本實驗模擬了實體瘤的低氧微環(huán)境,采用不同濃度的大黃素干預胃癌SGC7901細胞,發(fā)現(xiàn)大黃素可明顯抑制低氧環(huán)境下SGC7901細胞的增殖,而且抑制率隨濃度和時間的增加而增大,證實了大黃素的抗腫瘤活性。

        免疫組織化學結(jié)果顯示,HIF-1α在SGC7901細胞中的表達隨大黃素濃度增加而降低(r=-0.646,P=0.023<0.05),而E-cadherin蛋白的表達則與大黃素質(zhì)量分數(shù)呈負相關(r=0.816,P=0.001<0.05)。大黃素干預后,HIF-1α和E-cadherin蛋白的表達呈現(xiàn)出了相反的趨勢,這一結(jié)論和多數(shù)學者研究結(jié)果相同,即E-cadherin是HIF-1α下游的靶基因,HIF-1α可活化上調(diào)E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子[4-5]。因此,筆者認為大黃素可能通過降低HIF-1α,上調(diào)E-cadherin的表達這條通路,來殺傷腫瘤細胞,從而達到治療腫瘤的目的。

        在實驗過程中,筆者發(fā)現(xiàn)大黃素還可影響SGC7901細胞的形態(tài)。正常生長的SGC7901細胞為多邊形,核大、位于細胞中央,細胞間橋密集可見。隨著大黃素濃度的增加,細胞呈現(xiàn)多態(tài)性,其表面的突起逐漸變得粗大、延長,最后體積逐漸縮小,變?yōu)樾A形,細胞間橋也隨細胞與細胞之間的距離增大而消失。筆者推斷細胞出現(xiàn)這種變化的原因可能為:大黃素影響了腫瘤細胞之間的連接作用,而發(fā)揮這一作用的蛋白質(zhì)是E-cadherin,免疫組織化學結(jié)果也恰好證實了這一點[6-11]。

        根據(jù)本實驗結(jié)果推斷:在低氧環(huán)境下,大黃素可能通過降低HIF-1α和增強其下游靶基因E-cadherin的表達這一通路來減弱腫瘤細胞對缺氧的耐受,使其增殖、遷移活性下降,甚至死亡,從而實現(xiàn)治療腫瘤的效果。

        猜你喜歡
        培養(yǎng)箱黃素低氧
        嬰兒培養(yǎng)箱的質(zhì)控辦法及設計改良探討
        間歇性低氧干預對腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復的影響
        微生物培養(yǎng)箱的選購與管理
        食品工程(2020年3期)2020-01-05 14:38:16
        穿越時光的黃素石樓
        海峽姐妹(2019年8期)2019-09-03 01:01:02
        當藥黃素抗抑郁作用研究
        當藥黃素對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用
        漆黃素固體分散體的制備
        中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:32
        基于模糊PID參數(shù)自整定的細胞培養(yǎng)箱溫度控制算法
        Wnt/β-catenin信號通路在低氧促進hBMSCs體外增殖中的作用
        裸鼴鼠不同組織中低氧相關基因的表達
        免费的小黄片在线观看视频 | 精品国内在视频线2019| 久久综合九色综合欧美狠狠 | 久久午夜无码鲁丝片直播午夜精品| 国产亚洲欧美日韩综合一区在线观看| 精品在免费线中文字幕久久| 无码三级在线看中文字幕完整版| a级毛片免费观看视频| av无码av在线a∨天堂app| 在线观看一区二区女同| 蜜桃伦理一区二区三区| 日韩在线不卡一区三区av| 久久久久九九精品影院| 99精品久久99久久久久| 亚洲精品无码久久久| 在线va免费看成| 国产午夜精品福利久久| 日本道免费一区日韩精品| 伊人婷婷综合缴情亚洲五月| 亚洲 欧美 偷自乱 图片| 欧洲vat一区二区三区| 99久久久无码国产精品9| 亚洲AV无码一区二区一二区教师| 国产超碰人人一区二区三区| 偷拍熟女露出喷水在线91| 五月激情综合婷婷六月久久| 欧美俄罗斯40老熟妇| 日韩爱爱网站| 久久亚洲精品一区二区| 白白色免费视频一区二区在线| 亚洲 日韩 激情 无码 中出| 亚洲毛片αv无线播放一区| 国产超碰人人爽人人做人人添| 免费大片黄在线观看| 久久久久亚洲AV无码去区首| 成人自拍偷拍视频在线观看| 亚洲a∨无码精品色午夜| 无码午夜成人1000部免费视频| 久久久精品久久波多野结衣av| 天天躁日日躁狠狠躁av| 高清在线亚洲中文精品视频|