口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種烈性、急性、熱性、接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織列為必須報告的傳染病。在世界上許多國家或地區(qū)都有發(fā)生和流行，對養(yǎng)殖業(yè)及相關(guān)行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國通過實施強(qiáng)制免疫來防控該病，而免疫后產(chǎn)生的抗體水平是評價疫苗質(zhì)量和免疫效果的重要手段，也是制定合理免疫程序的科學(xué)依據(jù)。但在實際檢測中，常因抗體檢測方法不同而使結(jié)果存在一定偏差，同一份樣品采用不同的方法得出不同的判定結(jié)果也偶有出現(xiàn)，因此選擇科學(xué)合理的檢測方法，是進(jìn)行科學(xué)評價免疫質(zhì)量的基礎(chǔ)。因此，本檢測室使用口蹄疫病毒 VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體競爭ELISA試劑盒和口蹄疫液相阻斷ELISA 檢測試劑盒對口蹄疫O型免疫抗體進(jìn)行檢測并作對比分析。

競爭ELISA抗體檢測是應(yīng)用間接競爭法的模型將抗原包被，用HRP-抗體與樣本一起加入。樣本中的Ag與Solid-Ag競爭HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab與樣本中的Ag濃度成反比。本法使將小分子抗原包被在酶標(biāo)板上，檢測時加入待測樣本，使樣本中的待測抗體與酶標(biāo)板上的抗原結(jié)合。然后加入HRP酶標(biāo)記的抗體，此抗體也可與酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合，由于酶標(biāo)板上固定了一定數(shù)量的抗原，因此當(dāng)樣本中抗體的量越多，則HRP酶標(biāo)記抗體可結(jié)合的包被抗原就越少，兩種抗原競爭結(jié)合包被抗體，所以為競爭法。

液相阻斷ELISA 抗體檢測是應(yīng)用雙抗體夾心法的模型，針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。適用于測定大分子抗原及對應(yīng)的抗體，不適用于測定半抗原及小分子單價抗原及對應(yīng)的抗體，因為它不能形成兩位點夾心。ELISA是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)，過程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測抗體（抗原），再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原），生成抗原（抗體）-待測抗體（抗原）-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物發(fā)生有色反應(yīng)。最終通過酶標(biāo)儀的光吸收計算抗體（抗原）的量。

一、材料與方法

1.實驗器材。單道、12道移液器若干、96孔U型反應(yīng)板若干、37℃恒溫生化培養(yǎng)箱、100 ml量筒、iMark-酶標(biāo)儀。

2.血清樣品。隨機(jī)采集進(jìn)行了豬口蹄疫O型滅活疫苗二次免疫后約40 d的95～120日齡育肥血液樣品48份，分離血清，放置4℃冰箱保存待測。

二、診斷試劑

口蹄疫抗體O型競爭ELISA試劑盒為科研單位提供的試驗用品，口蹄疫O型液相阻斷ELISA檢測試劑盒購自中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所診斷中心，批號為20171205101-5。

三、檢測方法及結(jié)果判定

1.口蹄疫抗體O型競爭ELISA。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，計算兩孔的平均OD值后乘以0.6，該值即為臨界值，表示阻斷40%反應(yīng)的對照OD值。待測樣品OD值＞臨界值，判為陰性孔；待測樣品OD值 臨界值判為陽性孔，陽性孔的最高稀釋倍數(shù)即為該樣品的抗體效價，抗體效價＞1∶16判定為抗體合格。

2.口蹄疫抗體O型液相阻斷ELISA。嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，計算兩孔的平均OD值后乘以0.5，該值即為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對照OD值。待測樣品OD值＞臨界值，判為陰性孔；待測樣品OD值≦臨界值判為陽性孔，陽性孔的最高稀釋倍數(shù)即為該樣品的抗體效價，豬血清抗體效價≧1∶64判定為抗體合格；牛血清抗體效價≧1∶128判定為抗體合格。

四、結(jié)果

經(jīng)檢測分析，競爭ELISA檢測豬血清O型合格率為91.7%；液相ELISA檢測豬血清O型合格率也為91.7%。兩種方法檢測豬血清O型抗體合格率符合度均為100%。

從檢測抗體效價的整體結(jié)果來看，兩種方法測得的抗體效價不存在明顯的相關(guān)性，但當(dāng)競爭ELISA測得的抗體效價≧1∶180時，競爭ELISA與液相ELISA的抗體效價為1∶2的關(guān)系；由于競爭ELISA測得的抗體效價≧1∶180的樣品只有5份，若要證實此觀點，還需更多的檢測數(shù)據(jù)來支撐。

表1 競爭ELISA與液相ELISA檢測豬O型口蹄疫免疫抗體結(jié)果

表2 豬血清樣品抗體檢測效價

(續(xù)表)

五、分析與討論

檢測結(jié)果顯示，競爭ELISA與液相ELISA兩種檢測方法的抗體合格率完全符合，檢測同一血清的抗體效價并無明顯的對應(yīng)關(guān)系，兩種檢測方法均有較高的敏感性和特異性，試驗方法科學(xué)合理，試驗結(jié)果真實可靠。

檢測結(jié)果中競爭ELISA方法明顯低于液相ELISA方法檢測樣品的抗體效價，可能是競爭ELISA方法使用口蹄疫病毒 VP1結(jié)構(gòu)蛋白作為結(jié)合抗原，而液相ELISA使用口蹄疫全病毒作為結(jié)合抗原，全病毒含有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，相比競爭ELISA方法反應(yīng)程度更強(qiáng)。但隨著稀釋滴度的增加，抗原抗體反應(yīng)特異性更加明顯，受客觀客觀因素的影響會越來越小，兩種方法測得的抗體效價對應(yīng)關(guān)系趨于穩(wěn)定。

兩種方法都通過儀器設(shè)備判定結(jié)果，無人為因素干擾，這樣會大大提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。相比競爭ELISA方法，液相ELISA操作步驟繁多，試驗所需時間長，同時要求檢測人員技術(shù)熟練，要求技術(shù)評估人員有較強(qiáng)的數(shù)據(jù)綜合分析能力。

我國各省市、區(qū)縣每年都要投入大量的資金來支持重大動物疫病防控免疫效果的評估工作，但檢測結(jié)果常因疫苗來源的不同、檢測方法及檢測試劑不一致造成一定的偏差，尤其是在樣本較少的情況下，檢測結(jié)果的差異化更加明顯。所以，筆者認(rèn)為通過運(yùn)用不同方法進(jìn)行試驗比對，探索出一套免疫抗體監(jiān)測體系，能夠更客觀的評價疫苗質(zhì)量，更全面的評估疫苗免疫效果及免疫效力，為疫苗用戶提供更為優(yōu)質(zhì)化的技術(shù)服務(wù)。