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        四川地區(qū)豬源致病性大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性檢測(cè)

        2018-10-17 07:32:34張敏李旭廷王斌雷昌偉李思聰王紅寧
        四川畜牧獸醫(yī) 2018年10期
        關(guān)鍵詞:麥康凱豬源致病性

        張敏 ,李旭廷 ,王斌 ,雷昌偉 ,李思聰 ,王紅寧 *

        (1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 成都 610065;2.四川省畜牧科學(xué)研究院,四川 成都 610066)

        大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道共生菌群的組成部分,部分致病性大腸桿菌能引起人和動(dòng)物的腹瀉、敗血癥等多種癥狀[1]。大腸桿菌在藥物選擇壓力下,易產(chǎn)生耐藥性,并可通過(guò)菌毛將耐藥質(zhì)粒傳遞給其他大腸桿菌,因而給大腸桿菌病的藥物防控帶來(lái)了較大的挑戰(zhàn)[2]。本研究對(duì)四川地區(qū)的豬源樣品進(jìn)行了大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析,以期為合理使用抗生素提供依據(jù)。

        1 材料

        1.1 樣本采集 從四川地區(qū)40個(gè)豬場(chǎng)采集病死豬的腸道內(nèi)容物、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、血液作為病料樣本,置無(wú)菌樣品袋中,冰盒保存,12h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。

        1.2 試劑和標(biāo)準(zhǔn)菌株 麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、MH瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、藥敏紙片,購(gòu)自杭州天和微生物試劑公司;標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 25922),購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系SPF小鼠,購(gòu)自四川達(dá)碩生物技術(shù)有限公司。

        2 分離鑒定方法

        2.1 病料接種 無(wú)菌切取病變組織和正常組織交界處的小組織塊置肉湯培養(yǎng)基中,37℃下增菌培養(yǎng)24h。然后蘸取增菌液劃線于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,37℃純化培養(yǎng)24h。

        2.2 菌落形態(tài)特征觀察 當(dāng)伊紅美藍(lán)瓊脂上出現(xiàn)黑棕色或棕綠色且?guī)в薪饘俜垂獾木?,或出現(xiàn)中心黑點(diǎn)、邊緣灰白的表面光滑的菌落;麥康凱瓊脂上出現(xiàn)典型紅色或粉紅色的光滑菌落;1000×油鏡下觀察為革蘭氏陰性桿菌。符合以上特征的基本判定為大腸桿菌,然后作進(jìn)一步的分子鑒定。

        2.3 16S rDNA PCR測(cè)序鑒定[3]從伊紅美藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂上挑取純化后的典型單個(gè)菌落進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn),擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因。引物為通用引物27F(5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,)和 1492R(5,-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3,),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件:95℃5min,95℃ 1min、50℃ 1min、72℃ 2min(30次循環(huán)),72℃ 8min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),預(yù)擴(kuò)增片段1 450 bp,并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測(cè)序,序列結(jié)果用 NCBI BLAST搜索比對(duì),鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥97%判定。

        2.4 致病性試驗(yàn) 將鑒定了的豬源大腸桿菌接種到MH 瓊脂平板,經(jīng) 37℃ 24h純培養(yǎng)后,用滅菌生理鹽水洗下菌落,調(diào)整菌液渾濁度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽?×108CFU/mL)相當(dāng),再分別腹腔注射小白鼠(0.2mL/只),每株菌同時(shí)接種3只小鼠,并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC 25922為對(duì)照,觀察分離菌株對(duì)小鼠的致病性。

        2.5 藥敏試驗(yàn) 菌株于MH肉湯中37℃恒溫培養(yǎng)8~12h后,使用光度比濁儀將培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋為0.5倍麥?zhǔn)蠞舛?。再用滅菌棉簽劃線接種于整個(gè)表面干燥的MH瓊脂平板上,并確保每次接種均勻分布。然后用藥敏紙片分散器將紙片均勻貼在瓊脂平板表面,37℃恒溫培養(yǎng)12~16h后,測(cè)量抑菌圈大小。

        3 結(jié)果

        3.1 細(xì)菌分離 從40個(gè)豬場(chǎng)采集的125個(gè)病料樣品中,分離到了37株大腸桿菌,分離率達(dá)29.6%。各個(gè)臟器的分離率分別為:腸道內(nèi)容物45.95%(17/37),肺臟 13.52%(5/37),淋 巴結(jié) 8.1%(3/37),肝臟10.81%(4/37),心臟 5.4%(2/37),脾臟 8.1%(3/37),腎臟 2.72%(1/37),血液 5.4%(2/37)。

        3.2 致病性試驗(yàn) 用37株大腸桿菌攻毒小鼠后,有9株導(dǎo)致1只小鼠死亡,16株導(dǎo)致2只小鼠死亡,12株導(dǎo)致3只小鼠死亡,平均致死率為69.36%。引起至少2只小鼠死亡的28株菌中,有24株引起小鼠死亡的時(shí)間不超過(guò)18h。從死亡小鼠的肺臟、肝臟等器官中也分離到了同種菌。對(duì)照組無(wú)死亡。

        3.3 耐藥性檢測(cè) 37株大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明,分離株對(duì)四環(huán)素、阿莫西林、復(fù)方新諾明、氨芐西林、慶大霉素、強(qiáng)力霉素有嚴(yán)重耐藥性,耐藥率高于80%,四環(huán)素的耐藥率甚至達(dá)到了100%;對(duì)阿米卡星具有較高的敏感性,耐藥率為13.5%。37株大腸桿菌全部表現(xiàn)為多重耐藥,至少耐6種及以上受試藥物,存在20種不同的耐藥譜。表明四川地區(qū)豬源大腸桿菌致病菌株的耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣。

        表1 大腸桿菌分離株的耐藥性檢測(cè)

        4 討論

        4.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示37株耐藥大腸桿菌對(duì)阿米卡星的敏感性較高,與2017年孔令漢等[4]、2015年王斌等[5]報(bào)道的結(jié)果一致,可能與該藥尚未允許在獸醫(yī)臨床使用有關(guān)。值得關(guān)注的是,分離菌株中仍有13.5%對(duì)阿米卡星耐藥,其耐藥機(jī)制值得進(jìn)一步探究。

        4.2 β-內(nèi)酰胺類抗生素不僅是獸醫(yī)臨床重要的抗生素,也是人醫(yī)臨床常用的抗生素品種,監(jiān)測(cè)動(dòng)物源細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性不僅對(duì)畜牧業(yè)健康發(fā)展有著重要意義,而且對(duì)人醫(yī)臨床也有著重要參考價(jià)值。本次試驗(yàn)分離的37株豬源大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林的耐藥性高達(dá)90%以上,與曾博等[6]、王斌等[5]研究的結(jié)果相似。特別值得關(guān)注的是,近年來(lái)復(fù)方β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類抗生素和頭孢類抗生素的耐藥性在顯著增加,可能與這兩類藥物在臨床上的大量使用有關(guān),建議養(yǎng)殖戶在使用抗生素治療豬病時(shí),先篩選出有效藥物再治療,以避免抗生素濫用。

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