張敏 ，李旭廷 ，王斌 ，雷昌偉 ，李思聰 ，王紅寧 *

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道共生菌群的組成部分，部分致病性大腸桿菌能引起人和動(dòng)物的腹瀉、敗血癥等多種癥狀[1]。大腸桿菌在藥物選擇壓力下，易產(chǎn)生耐藥性，并可通過(guò)菌毛將耐藥質(zhì)粒傳遞給其他大腸桿菌，因而給大腸桿菌病的藥物防控帶來(lái)了較大的挑戰(zhàn)[2]。本研究對(duì)四川地區(qū)的豬源樣品進(jìn)行了大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析，以期為合理使用抗生素提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣本采集 從四川地區(qū)40個(gè)豬場(chǎng)采集病死豬的腸道內(nèi)容物、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)、血液作為病料樣本，置無(wú)菌樣品袋中，冰盒保存，12h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2 試劑和標(biāo)準(zhǔn)菌株 麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、MH瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑公司；標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 25922），購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系SPF小鼠，購(gòu)自四川達(dá)碩生物技術(shù)有限公司。

2 分離鑒定方法

2.1 病料接種 無(wú)菌切取病變組織和正常組織交界處的小組織塊置肉湯培養(yǎng)基中，37℃下增菌培養(yǎng)24h。然后蘸取增菌液劃線于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，37℃純化培養(yǎng)24h。

2.2 菌落形態(tài)特征觀察 當(dāng)伊紅美藍(lán)瓊脂上出現(xiàn)黑棕色或棕綠色且?guī)в薪饘俜垂獾木?，或出現(xiàn)中心黑點(diǎn)、邊緣灰白的表面光滑的菌落；麥康凱瓊脂上出現(xiàn)典型紅色或粉紅色的光滑菌落；1000×油鏡下觀察為革蘭氏陰性桿菌。符合以上特征的基本判定為大腸桿菌，然后作進(jìn)一步的分子鑒定。

2.3 16S rDNA PCR測(cè)序鑒定[3]從伊紅美藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂上挑取純化后的典型單個(gè)菌落進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因。引物為通用引物27F（5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,）和 1492R（5,-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3,），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃5min，95℃ 1min、50℃ 1min、72℃ 2min（30次循環(huán)），72℃ 8min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，預(yù)擴(kuò)增片段1 450 bp，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化并測(cè)序，序列結(jié)果用 NCBI BLAST搜索比對(duì)，鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥97%判定。

2.4 致病性試驗(yàn) 將鑒定了的豬源大腸桿菌接種到MH 瓊脂平板，經(jīng) 37℃ 24h純培養(yǎng)后，用滅菌生理鹽水洗下菌落，調(diào)整菌液渾濁度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽?×108CFU/mL)相當(dāng)，再分別腹腔注射小白鼠（0.2mL/只），每株菌同時(shí)接種3只小鼠，并設(shè)標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC 25922為對(duì)照，觀察分離菌株對(duì)小鼠的致病性。

2.5 藥敏試驗(yàn) 菌株于MH肉湯中37℃恒溫培養(yǎng)8～12h后，使用光度比濁儀將培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋為0.5倍麥?zhǔn)蠞舛?。再用滅菌棉簽劃線接種于整個(gè)表面干燥的MH瓊脂平板上，并確保每次接種均勻分布。然后用藥敏紙片分散器將紙片均勻貼在瓊脂平板表面，37℃恒溫培養(yǎng)12～16h后，測(cè)量抑菌圈大小。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離 從40個(gè)豬場(chǎng)采集的125個(gè)病料樣品中，分離到了37株大腸桿菌，分離率達(dá)29.6%。各個(gè)臟器的分離率分別為：腸道內(nèi)容物45.95%（17/37），肺臟 13.52%（5/37），淋 巴結(jié) 8.1%（3/37），肝臟10.81%（4/37），心臟 5.4%（2/37），脾臟 8.1%（3/37），腎臟 2.72%（1/37），血液 5.4%（2/37）。

3.2 致病性試驗(yàn) 用37株大腸桿菌攻毒小鼠后，有9株導(dǎo)致1只小鼠死亡，16株導(dǎo)致2只小鼠死亡，12株導(dǎo)致3只小鼠死亡，平均致死率為69.36%。引起至少2只小鼠死亡的28株菌中，有24株引起小鼠死亡的時(shí)間不超過(guò)18h。從死亡小鼠的肺臟、肝臟等器官中也分離到了同種菌。對(duì)照組無(wú)死亡。

3.3 耐藥性檢測(cè) 37株大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，分離株對(duì)四環(huán)素、阿莫西林、復(fù)方新諾明、氨芐西林、慶大霉素、強(qiáng)力霉素有嚴(yán)重耐藥性，耐藥率高于80%，四環(huán)素的耐藥率甚至達(dá)到了100%；對(duì)阿米卡星具有較高的敏感性，耐藥率為13.5%。37株大腸桿菌全部表現(xiàn)為多重耐藥，至少耐6種及以上受試藥物，存在20種不同的耐藥譜。表明四川地區(qū)豬源大腸桿菌致病菌株的耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣。

表1 大腸桿菌分離株的耐藥性檢測(cè)

4 討論

4.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示37株耐藥大腸桿菌對(duì)阿米卡星的敏感性較高，與2017年孔令漢等[4]、2015年王斌等[5]報(bào)道的結(jié)果一致，可能與該藥尚未允許在獸醫(yī)臨床使用有關(guān)。值得關(guān)注的是，分離菌株中仍有13.5%對(duì)阿米卡星耐藥，其耐藥機(jī)制值得進(jìn)一步探究。

4.2 β-內(nèi)酰胺類抗生素不僅是獸醫(yī)臨床重要的抗生素，也是人醫(yī)臨床常用的抗生素品種，監(jiān)測(cè)動(dòng)物源細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性不僅對(duì)畜牧業(yè)健康發(fā)展有著重要意義，而且對(duì)人醫(yī)臨床也有著重要參考價(jià)值。本次試驗(yàn)分離的37株豬源大腸桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林的耐藥性高達(dá)90%以上，與曾博等[6]、王斌等[5]研究的結(jié)果相似。特別值得關(guān)注的是，近年來(lái)復(fù)方β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類抗生素和頭孢類抗生素的耐藥性在顯著增加，可能與這兩類藥物在臨床上的大量使用有關(guān)，建議養(yǎng)殖戶在使用抗生素治療豬病時(shí)，先篩選出有效藥物再治療，以避免抗生素濫用。