徐小明 ，鐘航 ，葛良鵬 ，孫靜 *

（1.重慶市畜牧科學院，農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶市養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 榮昌402460；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005）

根據(jù)發(fā)病機制和毒力因子差異，大腸桿菌可大體分為 ETEC、EIEC、UPEC、EPEC、EHEC 5 種血清型[1]。血清型還可以根據(jù)不同表面特異性抗原進行分型，優(yōu)勢大腸桿菌抗原種類主要有鞭毛（H）、菌體（O）、表面L型（K）三種抗原[2]?？乖帕胁煌?，大腸桿菌血清型亦復雜多變，可以多達幾千種，但致病性大腸桿菌血清型仍分布在有限范圍內(nèi)。本試驗從豬只糞便中分離大腸桿菌，進行血清型鑒定、耐藥性監(jiān)測，并建立耐藥譜，以期降低該病的發(fā)病率，提高治愈率。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 于重慶某規(guī)?；i場（共12棟豬舍）采集不同年齡段不同豬只的糞便樣品49個，并依次編號。其中，哺乳期仔豬1～4號為雄性，5～7號為雌性；保育期小豬8～10號為雄性，11～14號為雌性；生長育肥期中豬15～19號為雄性，20～21號為雌性；妊娠期母豬編號22～28號；哺乳期母豬編號29～35號；空懷期母豬編號36～42號；成熟公豬編號43～49號。采集范圍覆蓋所有豬舍。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 用無菌拭子伸入豬只肛門內(nèi)采集糞便[3]，冰盒運輸，于-20℃保存。隨機抽取不同日齡段的糞便樣品各三個，抽樣結(jié)果：哺乳期仔豬2、3、6號，保育期小豬 8、13、14 號，生長育肥期中豬 15、17、18 號，妊娠期母豬 22、26、27 號，哺乳期母豬 29、31、34 號，空懷期母豬 36、40、41 號，成熟公豬 43、45、48號，共計21個樣品。

1.2.2 細菌分離培養(yǎng) 在無菌操作臺將糞便樣品涂抹于麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h，選取單個可疑菌落交替接種于營養(yǎng)瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基[4]，重復培養(yǎng)至無其他形態(tài)的菌落出現(xiàn)。挑取單個典型菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)純化菌株，與甘油1∶1混合后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 生化鑒定 將純培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h后挑取單個菌落接種于硫化氫、甘露醇、尿素、山梨醇、葡萄糖、乳糖生化管，37℃培養(yǎng)24h，觀察并記錄結(jié)果，參考第八版伯杰氏細菌手冊進行比對。

1.2.4 耐藥性監(jiān)測 采用藥敏紙片法監(jiān)測21株菌對13種抗生素的敏感程度。方法：吸取200μL菌液均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂表面，待菌液完全吸收后，貼上藥敏紙片，紙片之間的間隔不少于2.5 cm（避免抑菌圈重疊），37℃培養(yǎng)24h后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑（測3組數(shù)據(jù)取平均值）[5]。敏感程度判斷標準：無抑菌圈為耐藥；抑菌圈直徑＜10mm為低度敏感；10mm＜抑菌圈直徑＜15mm為中度敏感；抑菌圈直徑＞15mm為敏感。

1.2.5 血清型鑒定 采用玻片凝集試驗鑒定21株菌是否是致病性血清型。用專用滴管在潔凈的玻片上滴1～2滴血清，取被檢菌少許與血清混勻，輕輕搖動玻片，1min內(nèi)肉眼判斷是否凝集，且以生理鹽水為對照。結(jié)果呈陽性時再與該多價血清對應的單價血清做凝集試驗，確定血清型。

1.2.6 DNA提取、16S rRNA區(qū)PCR擴增 菌株DNA提取參照酶消化法[6]，具體步驟參照DNA提取試劑盒說明書，提取3、17、34、40號的菌株 DNA（本試驗采用抗原分型法對分離的21株菌進行血清型分型，選其中4個樣品以確定該豬場大腸桿菌的同源性）。引物采用 16S rRNA通用引物，上游引物：5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,，下游引物：5,-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3,[7]，產(chǎn)物長度約 1500bp。PCR 反應體系：1 μL DNA 模板，2.5 μL 上游引物（10mM），2.5μL下游引物（10mM），5μL dNTP，5μL 10×Buffer，1μL rTaq，33μL ddH2O。PCR 反應條件：94℃預變性 5min；94℃變性 45s，56℃退火 30s，72℃延伸90s，循環(huán)35次；最后72℃延伸10min。

PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并寄送蘇州金唯智生物科技有限公司進行雙向測序。最后，利用 Blast軟件（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將測序所得的序列與GenBank中已登錄的基因序列進行比對，分析其同源性[8]。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)、分離、鏡檢結(jié)果 所選21個樣品的豬源大腸桿菌分離率為100%。培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果顯示：在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、中等大小、四周整齊、光滑濕潤、半透明的菌落；在麥康凱培養(yǎng)基上形成圓形隆起、中等大小、四周整齊、桃紅色且中間顏色較深、光滑濕潤的菌落。鏡檢觀察到兩端鈍圓，大多數(shù)成對存在、少數(shù)分散的短桿狀紅色細菌。

2.2 生化鑒定結(jié)果 21株菌的生化特性表現(xiàn)為：甘露醇、乳糖、葡萄糖試驗均呈陽性，尿素試驗均呈陰性，山梨醇試驗大多數(shù)呈陰性、少數(shù)呈陽性，硫化氫試驗多數(shù)呈陰性、少數(shù)呈陽性。

2.3 耐藥性監(jiān)測 用藥敏紙片法監(jiān)測耐藥性，培養(yǎng)出的抑菌圈形狀規(guī)則、界限明顯。分離的21株菌對13種抗生素的敏感程度詳見表1。分析可知，該豬場大腸桿菌耐藥率分別為：頭孢曲松、頭孢哌酮、恩諾沙星、環(huán)丙沙星0%，新霉素4.76%，諾氟沙星、頭孢噻肟9.52%，頭孢唑林、阿奇霉素19.05%，四環(huán)素71.43%，復方新諾明76.19%，阿莫西林、青霉素100%。

表1 21株細菌對抗生素的敏感程度

圖1 21株被檢菌的耐藥圖譜

分離菌株的多重耐藥性如圖1所示?？梢姳粰z菌株均表現(xiàn)出多重耐藥性，最少為3耐、最多為6耐，其中4耐最為嚴重。多重耐藥性具體比例為：3耐占 19.05%，4耐占 57.14%，5耐占 9.2%，6耐占14.29%。

2.4 血清型鑒定 血清玻片凝集試驗顯示：左側(cè)生理鹽水無凝集現(xiàn)象，右側(cè)發(fā)生凝集，表明該株菌攜帶致病性血清。所測21個樣品中，致病性血清型表現(xiàn)為：3 號哺乳仔豬為腸道致病性 O126∶K71（B16）型血清，48號妊娠母豬為腸道侵襲性O112∶K66型血清，其余均為非致病性血清型。

2.5 電泳成像及Blast比對結(jié)果 對16S rRNA通用引物的擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。M為DL2000，可在約1500bp處觀察到明顯的清晰、無尾條帶。

4株菌PCR產(chǎn)物的堿基序列相似度達99%。同源性比對結(jié)果表明，所檢測序列與Swine fecal bacterium RF1A-Cel5 16s ribosomal RNA partial sequence（FJ753832.1）的大腸桿菌序列相似度達99%，進一步證明所分離菌株為大腸桿菌。

圖2 DNA電泳結(jié)果

3 討論

3.1 培養(yǎng)形態(tài)和鏡檢特征 本試驗所分離的21株菌均能在麥康凱和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成單個菌落，形態(tài)與林振華等[9]報道的一致。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果與郭劍英等[10]報道的一致，符合大腸桿菌特性。

3.2 生化特性分析 所分離的21株菌的生化鑒定結(jié)果符合大腸桿菌特性。但樣品中有少量菌株的硫化氫檢測呈陽性，這似乎與其生化特性不符，根據(jù)之前也有大腸桿菌硫化氫試驗呈陽性反應的報道[11]，并結(jié)合鏡檢結(jié)果、DNA序列同源性比對等分析，仍可確認為大腸桿菌。

3.3 耐藥性分析 該豬場被檢21株菌均表現(xiàn)為多重耐藥，以4耐（占57.14%）最為嚴重。其中對頭孢曲松、頭孢哌酮、恩諾沙星、環(huán)丙沙星無耐藥性，建議臨床治療大腸桿菌病使用這些藥物；對阿莫西林、青霉素表現(xiàn)為完全耐藥，該豬場可以棄用；其余7種藥物雖然能在一定程度上治療大腸桿菌病，但某些菌株已產(chǎn)生耐藥性，建議不再使用。在使用藥物治療該病時，建議交叉用藥，切記避免持續(xù)使用同種藥物，以免產(chǎn)生耐藥性[12]。

不同地區(qū)的大腸桿菌耐藥性存在一定的差異，且比較后發(fā)現(xiàn)各個地區(qū)的大腸桿菌對藥物的耐藥性都較為嚴重，因此不同豬場都應常年監(jiān)測大腸桿菌耐藥性，以便及時有效地控制和治療該疾病。

3.4 血清型鑒定 所測的21個樣品中，3號、48號豬只攜帶致病性血清，已將豬只無害化處理以免擴散。但需要強調(diào)的是，大腸桿菌為條件性致病菌，正常菌株在一定條件下也可衍變?yōu)橹虏⌒跃辍Ｒ虼?，日常養(yǎng)殖中一定要加強飼養(yǎng)管理，采取定期消毒、接種疫苗等方式預防和減少大腸桿菌病的發(fā)生和蔓延，確保豬場收益。

4 結(jié)論

本試驗所分離菌株均為大腸桿菌，且多重耐藥性明顯，建議使用頭孢曲松、頭孢哌酮、恩諾沙星、環(huán)丙沙星治療，用藥過程中還應避免長時間使用同種藥物。其中有兩頭豬攜帶大腸桿菌致病性血清，已進行無害化處理。