成 昭，周 磊,苗延青,梁 飛

(西安醫(yī)學院 藥學院/藥物化學研究所,陜西 西安 710021)

藥物分子標記與示蹤可實現(xiàn)藥物代謝的可視化,對于藥物濃度和藥代動力學研究、藥效評價具有重要意義。傳統(tǒng)的同位素標記法需借助于放射顯影技術實現(xiàn)藥物分布部位(定性)和分布量(定量)實時研究,或借助采集血樣、尿樣等代謝樣本,再進一步聯(lián)用氣相色譜-質譜進行分析,因而活體應用受限,更適用于血藥濃度動力學、組織分布及排泄物分析等。借助光學定性與定量分析手段示蹤藥物分子、研究其分布與代謝,能夠有效避免活體損傷、簡化分析手段。將熒光衍生技術應用于藥物分子的熒光標記、借助熒光成像即時示蹤藥物分子,直觀可視地監(jiān)測其分布、轉運及利用的變化,可揭示藥物作用路徑、進行藥理學分析,進一步評價藥效,對研究藥物作用的信號通路、進行疾病治療具有重要意義。

本論文設計了以熒光衍生試劑特異性標記藥物分子的某些原子或基團,以共價結合、弱作用力吸附等方法實現(xiàn)待分析物的可視化標記[1-2]。選擇蛋白質N-端標記試劑丹磺酰氯(N,N-二甲氨基-5-萘磺酰氯,Dimethylamino Naphthalene Sulfonyl Chloride,DNS-Cl),經(jīng)過以簡單含氮物建立反應條件、復雜含氮物確立衍生條件、實現(xiàn)藥物分子中非活性氨基標記的遞進式實驗方案,檢出DNS-Cl特征熒光信號,進行藥物分子的定性及定量考查;并進一步借助熒光成像技術示蹤藥物分子[3-4],為藥物作用路徑研究提供了一種直觀可視的方法。分析藥物代謝周期內標記物的光穩(wěn)定性,并對標記產物進行光學性質分析與體外活細胞評價實驗,探究標記物在體外活細胞實驗中的作用效果。實驗方案具有操作簡便、取樣量少、標記穩(wěn)定性高等優(yōu)勢,且能夠對分析物進行多參數(shù)考查,如熒光強度、量子產率、熒光壽命、標記光穩(wěn)性能等,可應用于多種生物樣品[5-9]和環(huán)境樣品的分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度計(UV-2102 PCS,廣州滬瑞明儀器有限公司),熒光分光光度計(LS55,鉑金埃爾默股份有限公司),倒置熒光顯微鏡(U-LH 100 hG IX73,成貫儀器有限公司),多功能酶聯(lián)檢測儀(1510 Mwltiskan Go,賽默飛世爾科技有限公司)。

丹磺酰氯(HPLC,阿拉丁試劑公司),鄰苯二胺(AR,阿拉丁試劑公司),對苯二胺(AR,阿拉丁),鄰氨基苯酚(AR,阿拉丁試劑公司),N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(AR,阿拉丁試劑公司),阿莫西林膠囊(0.25 g,哈藥集團制藥總廠),硝苯地平緩釋片(I)(10 mg,揚子江藥業(yè)集團江蘇制藥股份有限公司),葉酸(400 μg,美國健安喜營養(yǎng)食品公司),克拉霉素分散片(0.25 g,廣東怡康制藥有限公司),奧美拉唑腸溶膠囊(20 mg,沈陽圣元藥業(yè)有限公司)。

1.2 熒光衍生標記

DNS-Cl的衍生標記反應需在堿性條件下進行[10-11],本文將 DNS-Cl分別應用于硝苯地平、阿莫西林、葉酸、克拉霉素、奧美拉唑等含氮藥物中非剛性氮原子的熒光標記(圖1)。

1.2.1 簡單含氮物 將1.0 mg DNS-Cl，3.4 mg鄰苯二胺，25.0 mg碳酸鉀及2.5 mL乙酸乙酯加入50 mL圓底燒瓶中,進行衍生標記,薄層板監(jiān)測反應。分別考查了60℃及80℃的反應溫度,確定衍生反應時間為20 min、反應溫度為80℃。并進行80℃下的重復實驗,反應重現(xiàn)性良好。

上述條件也適用于簡單含氮物對苯二胺及鄰氨基苯酚的熒光衍生反應。

1.2.2 復雜含氮物 將1.0 mg DNS-Cl，3.4 mg N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽，25.0 mg碳酸鉀，2.5 mL乙酸乙酯加入50 mL圓底燒瓶中,80℃下回流反應35 min,薄層板監(jiān)測。

1.2.3 含氮藥物 實驗中所用含氮藥物均為藥店購入藥品,應去除輔料干擾。藥物輔料一般使用淀粉、糖粉等作為稀釋劑或崩解劑,或可溶性枸櫞酸作為pH調節(jié)輔料,利用其不溶于有機溶劑的特性,根據(jù)平均片重及每片有效含量計算藥物分子含量、進行藥物片劑或膠囊內劑的準確稱重,使用有機溶劑進行充分溶解,再離心取上清液,即可去除干擾。

準確稱取5.8mg阿莫西林,于離心管中加3 mL甲醇振蕩溶解,6 000 r/min離心5 min取上清液,去除輔料干擾;將1.0 mg DNS-Cl，阿莫西林甲醇提取液，50.0 mg碳酸鉀及5 mL乙酸乙酯加入50 mL圓底燒瓶中,80℃油浴加熱回流2 h,薄層板監(jiān)測反應。

同理,阿莫西林、葉酸、克拉霉素、奧美拉唑等含氮藥物進行熒光衍生反應的試劑用量分別為143.9 mg硝苯地平，3.5 mL甲醇，4.0 mg DNS-Cl，100 mg碳酸鉀及10 mL乙酸乙酯(80℃回流2 h);1.1 g葉酸，15 mL甲醇，1.0 mg DNS-Cl，25.0 g碳酸鉀及2.5 mL乙酸乙酯(80℃回流1.1 h);34.6 mg克拉霉素，3 mL甲醇，2.0 mg DNS-Cl，25.0 mg碳酸鉀及5 mL乙酸乙酯(80℃回流2.5 h);67.1 mg奧美拉唑，3.0 mL甲醇，1.0 mg DNS-Cl，25.0 mg碳酸鉀，5 mL乙酸乙酯(80℃回流1.6 h)。

圖1 熒光衍生路線Fig.1 Fluorescence derivatization route

1.3 熒光衍生標記穩(wěn)定性分析

保持DNS-Cl-阿莫西林衍生物反應液恒溫37℃下,分別在0，2，20，24，31，44，48，52 h取樣,蒸餾水定容，得到濃度為1×10-4mol/L的溶液,分析DNS-Cl熒光最大發(fā)射波長462 nm處熒光強度隨時間的穩(wěn)定性。評價阿莫西林體內半衰期及藥物完全代謝排出體外之前,DNS-Cl能否有效標記藥物分子,實現(xiàn)藥物代謝周期內直觀可視的代謝路徑示蹤。

另對DNS-Cl-硝苯地平(0，3，5，17，25，42，48，49，77 h)，DNS-Cl-葉酸(0，3，6，18，21，24，28，51，67 h)，DNS-Cl-克拉霉素(0，3，7，21，46，49，52，55，69 h)及DNS-Cl-奧美拉唑(0，7，21，25，29，45，57，69 h)等熒光衍生產物進行了相似間隔取樣分析。

1.4 細胞評價實驗

1.4.1 細胞毒性評價 采用MTT法[8]對DNS-Cl-硝苯地平、DNS-Cl-克拉霉素衍生產物進行體外細胞毒性評價。取對數(shù)生長期的受試細胞(ECV304人臍靜脈內皮細胞株)制備細胞懸液,密度約為5×104個/mL,加入96孔板中,每孔細胞數(shù)8 000～10 000個。待細胞貼壁后,各樣品按起始濃度倍數(shù)稀釋加入各自組中,每組為2個平行孔,設定體積分數(shù)0.1% DMSO為溶劑對照。加藥后置于37℃，體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗終止前4 h每孔加入100 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，再培養(yǎng)4 h。測定前，徹底棄去培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO,使用酶標儀在490 nm處測定OD值,利用下式計算細胞增殖抑制率,抑制率%=[(1-OD藥液/OD對照)×100%][9]。

1.4.2 細胞熒光標記 取對數(shù)生長期的受試細胞(ECV304人臍靜脈內皮細胞株)制備細胞懸液,密度約為5×104個/mL,加入6孔板中,每孔細胞數(shù)8 000～10 000個,待細胞貼壁后,各樣品按起始濃度倍數(shù)稀釋(5 000，10 000，20 000 μmol/L)加入各孔中,加藥后置于37℃，體積分數(shù)5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后用PBS buffer清洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察,可看到藍色熒光發(fā)射通道內細胞有綠色熒光表達。在明場中拍攝聚集生長且形態(tài)完整良好的細胞,并在暗場中拍攝熒光成像。

2 結果與討論

2.1 熒光衍生標記及穩(wěn)定性分析

配制濃度為1×10-5mol/L 的DNS-Cl-鄰苯二胺衍生產物水溶液,以314 nm波長激發(fā),得到熒光光譜(圖2(a))。結果顯示，60℃及80℃的反應溫度考查、及80℃下的重復實驗,衍生產物熒光強度穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好。相同條件下進行了DNS-Cl與對苯二胺、鄰氨基苯酚的熒光衍生,實驗結果同鄰苯二胺。

80℃下,DNS-Cl-N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽熒光衍生反應重現(xiàn)性良好(圖2(b)),進一步驗證了熒光衍生條件。

進行1×10-4mol/L濃度DNS-Cl-硝苯地平衍生物熒光光譜分析(圖2(c)),可知DNS-Cl可標記硝苯地平分子中含氮雜環(huán)上的仲胺基。同理,DNS-Cl可有效標記阿莫西林分子中的伯胺基、仲胺基,葉酸伯、仲、叔胺基,克拉霉素叔胺基,奧美拉唑伯胺基、仲胺基。

間隔取樣法分析37℃恒溫下DNS-Cl對阿莫西林衍生標記的穩(wěn)定性,以DNS-Cl熒光最大發(fā)射波長462 nm處的熒光強度對時間作圖,得到光穩(wěn)定曲線圖3(a)。各時間點熒光強度波動較小,說明在阿莫西林體內半衰期61.3 min時間范圍內,及其完全代謝排出體外之前,DNS-Cl均能有效標記藥物分子,實現(xiàn)其代謝周期內直觀可視的代謝路徑示蹤。

同理,硝苯地平體內有效作用時間持續(xù)12 h,葉酸體內半衰期約為40 min,克拉霉素緩釋片半衰期約為7 h，完全代謝時間需5 d,奧美拉唑體內半衰期為0.5 h～1 h，有效血藥濃度可維持24 h。上述藥物代謝周期內,丹磺酰氯均能實現(xiàn)藥物分子的有效標記及全程示蹤(圖3(b)～(e))。

2.2 細胞評價實驗

2.2.1 細胞毒性評價 計算DNS-Cl-硝苯地平及DNS-Cl-克拉霉素衍生產物對體外人臍靜脈內皮細胞株ECV304增殖抑制率,得到表1及表2。

得到IC50回歸方程[12]為

Y=2.746 438 66+0.575 664×X(Y表示概率單位,X表示lgc),Y=5即抑制率為50%時, 反應物濃度c=8 217 μmol/L,則IC50=8 217 μmol/L。

表2得到的IC50回歸方程為Y=2.633 155+0.544 912×X(Y表示概率單位,X表示lgc),Y=5，即抑制率為50%時,反應物濃度c=22 056 μmol/L,則IC50=22 056 μmol/L。

由表1，2可知,硝苯地平、克拉霉素熒光標記物在體外活細胞環(huán)境中毒性低,可用于活體研究中,在生物學、醫(yī)學研究中具有良好的應用前景。

2.2.2 細胞熒光標記 分別進行DNS-Cl-硝苯地平、DNS-Cl-克拉霉素衍生產物與人臍靜脈內皮細胞株ECV304體外共孵育,低、中、高濃度梯度加樣,熒光共聚焦顯微鏡下拍攝成像,得到圖4，5。

圖3 熒光衍生產物光穩(wěn)定性(a) 丹磺酰氯-阿莫西林 (b) 丹磺酰氯-硝苯地平 (c) 丹磺酰氯-葉酸 (d) 丹磺酰氯-克拉霉素 (e) 丹磺酰氯-奧美拉唑(462 nm)Fig.3 Fluorescence Stability of (a) DNS-Cl-Amoxicillin, (b) DNS-Cl-Nifedipine, (c) DNS-Cl-Folic Acid, (d) DNS-Cl-Clarithromycinand (e) DNS-Cl-Omeprazole at 462 nm

c/μmol·L-1lgcOD1OD2平均值抑制率OD (對照)Y125.0002.0970.9780.8530.9160.8300.9240.102 250.0002.3980.7270.8620.7950.7090.9800.277 500.0002.6990.7960.8160.8060.7200.9410.235 1 000.0003.0000.7080.7590.7330.6480.9170.294 2 000.0003.3010.6140.6570.6350.5500.9160.400 4 000.0003.6020.7090.6590.6840.5980.9700.383

表2 DNS-Cl-克拉霉素衍生產物MTT數(shù)據(jù)Tab.2 MTT Experimental Data of DNS-Cl-Clarithromycin

圖4 丹磺酰氯-硝苯地平熒光衍生產物活細胞成像Fig.4 Living cells imaging of DNS-Cl-Nifedipine

圖5 丹磺酰氯-克拉霉素熒光衍生產物活細胞成像Fig.5 Living cells imaging of DNS-Cl-Clarithromycin

由圖4，5可看出，明場下細胞形態(tài)完整,暗場下熒光衍生產物進入細胞,且熒光成像良好,可用于藥物在體內代謝路徑示蹤,通過熒光成像技術,為藥物分子的代謝路徑研究提供了直觀可視、安全有效的實驗方法。

3 結 論

設計了遞進式、多層次的實驗方案,經(jīng)過簡單含氮化合物、復雜含氮化合物、含氮藥物分別與DNS-Cl進行衍生反應的實驗設計,建立了一種普遍適用的對含氨基藥物熒光標記的方法。進行丹磺酰氯與含氮藥物或化合物的衍生反應時,不需要添加催化劑,反應條件溫和,反應時間短、適用性廣、操作簡便快速。通過光穩(wěn)定性實驗及細胞評價實驗評價DNS-Cl對含氮化合物及藥物分子熒光標記的穩(wěn)定性[10-11]及低毒性[8-9,12-15],DNS-Cl不僅可以實現(xiàn)藥物分子半衰期內或代謝期內的熒光穩(wěn)定標記,而且可以實現(xiàn)細胞水平、分子水平的藥物作用代謝示蹤等,熒光標記產物在體外活細胞環(huán)境中安全有效,反應檢測直觀可視,具有較好應用前景。未來工作將進一步聯(lián)用色譜技術,表征藥物作用效果、研究藥物作用機制、進行藥物篩選等。