吳苑琪,劉魏征,范麗華,朱晨輝,段志廣,范代娣

(西北大學 化工學院, 陜西 西安 710069;2.同濟大學 生命科學與技術學院，上海 200092)

白癜風是以皮膚黑色素細胞功能缺失為特征的獲得性皮膚病,多表現(xiàn)為局限性或泛發(fā)性的皮膚黏膜色素脫失[1]。該病普遍認為是由于遺傳免疫、神經(jīng)精神、內(nèi)分泌代謝、環(huán)境及自由基的氧化損傷等多方面因素引起黑素細胞的破壞,從而導致色素脫失[2-3]。

人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3是從人參中提取出的一類有效成分,具有抗腫瘤、抗疲勞、增強免疫力等作用[5],能在一定程度上增強黑素細胞的活性。目前,在國內(nèi)報道過用白蒺藜、補骨脂等為主的中草藥治療白癜風[6],但至今尚未見有關于稀有人參皂苷組合物對白癜風治療的研究報告。因此本實驗通過MTT實驗研究人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物對體外黑素瘤細胞的抑制作用以及通過對實驗性豚鼠進行氫醌及過氧化氫脫色,對比研究人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物對白癜風動物模型的治療作用。

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3:本實驗室自制(純度90%);RPMI-1640細胞培養(yǎng)基:Gibco公司;MTT:北京索來寶公司;DMSO:Sigma公司;氫醌:天津市天力化學試劑有限公司;過氧化氫:西安化學試劑廠;硫化鈉:天津市天力化學試劑有限公司;血清酪氨酸酶(TYR)試劑盒、膽堿酯酶(CHE)試劑盒、單胺氧化酶(MAO)試劑盒:上海圻明生物科技有限公司。

1.2 細胞與動物

黑素瘤細胞B16-F10,購買于中國科學院細胞庫;花黑色豚鼠60只,體重180g～200g,購自第四軍醫(yī)大學動物實驗中心。

1.3 儀 器

80i正置顯微鏡，日本Nikon公司;多功能酶標儀，美國BioTek公司;電熱鼓風干燥箱，武漢海聲達儀器設備公司;臺式離心機，上海醫(yī)療器械廠;超低溫冰箱ULT1386-3-V34，美國REVCO;真空冷凍干燥機FREEZONE，美國LABCONCO;電子天平，瑞士MettlerTolledo公司。

1.4 MTT實驗

1.4.1 細胞培養(yǎng)和細胞增殖活性測定 取對數(shù)生長期的黑素瘤B16-F10細胞, 經(jīng)計數(shù)板計數(shù)、 1 640培養(yǎng)液稀釋,將其制備成密度為1.0×105個/mL的細胞懸液,將其接種于96孔板中,每孔100 μL(細胞密度約為每孔1.0×104個)。 培養(yǎng)24h后, 吸出原培養(yǎng)液, 加入終濃度為 62.5， 125， 250， 500μg/mL的人參皂苷組合物(人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物質(zhì)量比分別為m(Rh2)∶m(Rg3)=2∶8;m(Rh2)∶m(Rg3)=5∶5;m(Rh2)∶m(Rg3)=8∶2)。每一濃度設6個復孔,以含0.5% DMSO的1 640培養(yǎng)液作為陰性對照[7-9]。待48h后,用微量加樣槍吸出藥液。然后每孔加入濃度為5mg/mL的MTT溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸出原培養(yǎng)液,每孔加入150 μLDMSO,在室溫下振蕩10 min后,用酶標檢測儀在波長為A570下進行測定其吸光度值(OD)。

1.4.2 評價方法 按以下公式計算人參皂苷組合物對黑素瘤細胞增殖抑制率。

抑制率(%)=(對照組平均OD值-給藥組平均OD值)/對照組平均OD值×100%。

1.5 動物模型實驗

1.5.1 豚鼠白癜風模型的建立與給藥 取黑色或黑花色豚鼠60只,雌雄各半,選擇豚鼠背部黑灰色部位,4cm×4cm為單位作為試驗區(qū)。隨機分為空白對照組、模型對照組、高劑量組(2.0g/kg)和低劑量組(1.0g/kg),每組10只。除空白對照組外,在剩余50只豚鼠中隨機挑選25只在皮膚試驗區(qū)涂抹5%過氧化氫,另外25只涂抹7%氫醌,每次用量約1mL,每天1次,連續(xù)30d進行建模?？瞻讓φ战M每天涂抹等量純化水[10]。

待建模成功后,劑量組給予含1.0g/kg和2.0g/kg的人參皂苷組合物(人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3按照體積比5∶5混合)的鼠糧,空白對照組和模型對照組給予等量不加藥的鼠糧,持續(xù)40天。

1.5.2 肉眼觀察 每天按時觀察豚鼠的活動、進食、精神狀態(tài)和建模情況。每隔5d稱重1次,定期對動物試驗區(qū)皮膚進行觀察、拍照。建模成功后,肉眼觀察人參皂苷組合物對白癜風豚鼠模型的治療效果,并記錄其色素脫失情況。

模型成功標準:肉眼可觀察到豚鼠黑色皮膚變蒼白,隨著用藥時間的延長,有的出現(xiàn)白斑,甚至原有黑毛處長出白毛[11]。

療效判定標準:以豚鼠用藥部位中心3cm2為一觀察單位,以空白對照組皮膚顏色為參照,優(yōu)為受試區(qū)皮膚呈黑色;良為受試區(qū)皮膚呈棕黑色或棕色;中為受試區(qū)皮膚呈棕黃色;差為受試區(qū)皮膚呈黃色或白色;總有效率以優(yōu)加良計算[12-13]。

1.5.3 生化測定 將豚鼠于末次給藥后1 h,以20%烏拉坦腹注射麻醉(0.5 mL/100 g),于腹部主動脈取血,按照各試劑盒的說明書加入到抗凝管中,離心得到血漿,用于單胺氧化酶(MAO)、膽堿酯酶(CHE)、血清酪氨酸酶(TYR)等指標的檢測。

2 結(jié) 果

2.1 對細胞增殖的抑制作用

將人參皂苷Rh2與人參皂苷Rg3按照一定的質(zhì)量比(分別為2∶8，5∶5，8∶2)混合,配制終濃度為 62.5，125，250，500μg/mL的人參皂苷組合物,并與相同濃度的兩種皂苷Rh2和Rg3作為對照,作用于黑素瘤細胞B16-F10。比較3種不同比例人參皂苷Rh2，Rg3組合物對黑素瘤細胞的抑制作用。結(jié)果如圖1，2和3。

與對照組相比,不同濃度的人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物、人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3對黑素瘤細胞的增殖均有抑制作用。并且，人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物較人參皂苷Rh2、人參皂苷Rg3對黑素瘤細胞增殖的抑制作用更加顯著。其中,人參皂苷Rh2與人參皂苷Rg3以質(zhì)量比2∶8混合對黑素瘤細胞增殖的抑制率達到60%以上;人參皂苷Rh2與人參皂苷Rg3以質(zhì)量比5∶5混合黑素瘤細胞增殖的抑制率達到67%以上;人參皂苷Rh2與人參皂苷Rg3以質(zhì)量比8∶2混合黑素瘤細胞增殖的抑制率達到65%以上。

2.2 豚鼠白癜風模型實驗結(jié)果

2.2.1 白癜風模型建立 7%(質(zhì)量分數(shù))氫醌建模30天后試驗區(qū)出現(xiàn)明顯白斑白毛,在有些白斑周圍皮膚光滑,無法長出毛發(fā)。實驗區(qū)其余部分毛發(fā)呈灰色,與空白對照組試驗區(qū)的黑色毛發(fā)有明顯差別。肉眼觀察5%(體積分數(shù))過氧化氫模型,豚鼠皮膚表現(xiàn)蒼白并長出白毛,與空白對照組試驗區(qū)的黑色毛發(fā)有所差別。但是皮膚表面局部潰爛,與7%(質(zhì)量分數(shù))氫醌模型相比較不利于觀察。

圖1 人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物質(zhì)量比2∶8時對黑素瘤細胞增殖的抑制率Fig.1 The inhibition rate of ginsenosides Rh2 and ginsenosides Rg3 composition when the proportion of 2∶8 to melanoma cells proliferation

圖2 人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物質(zhì)量比5∶5時對黑素瘤細胞增殖的抑制率Fig.2 The inhibition rate of ginsenosides Rh2 and ginsenosides Rg3 composition when the proportion of 5∶5 to melanoma cells proliferation

圖3 人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物質(zhì)量比8∶2時對黑素瘤細胞增殖的抑制率Fig.3 The inhibition rate of ginsenosides Rh2 and ginsenosides Rg3 composition when the proportion of 8∶2 to melanoma cells proliferation

2.2.2 人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物治療豚鼠模型效果評估 人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物治療白癜風豚鼠模型的效果觀察見表1。

2.2.3 人參皂苷組合物對豚鼠血漿中MAO，CHE，TYR指標的影響 由表2可見,模型對照組豚鼠血漿中的MAO，CHE活力明顯增加,TYR活力明顯降低,與空白對照組比較,差異顯著。用藥后,實驗組豚鼠血漿中MAO，CHE活力明顯降低,TYR活力明顯增加,與模型對照組比較,差異顯著。結(jié)果表明,人參皂苷組合物能夠明顯降低白癜風豚鼠模型血清中MAO，CHE的活力,增加TYR的活力。

表1 人參皂苷組合物對白癜風豚鼠模型的療效評定情況(n=10)Tab.1 Therapeutic effect evaluation situation of ginsenoside combination on guinea-pig model of vitiligo (n=10)

注:與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01

表2 人參皂苷組合物對豚鼠血漿中MAO，CHE，MDA指標的影響Tab.2 The effects of rare ginsenoside composition on the indexes of MAO, CHE and MDA in guineapig plasma

注:與正常組比較,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3 討 論

實驗早期我們用體外培養(yǎng)鼠黑素瘤細胞B16-F10,觀察不同濃度、不同比例的人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3的組合物、人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3對其生長的抑制率。通過實驗發(fā)現(xiàn),不同濃度、不同比例的人參皂苷對黑素瘤細胞有不同的抑制率,當人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3的組合物以質(zhì)量比5∶5混合且終濃度大于125μg/mL時,對黑素瘤細胞B16-F10的抑制率達到67%以上。由此證明，人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物可以抑制黑素瘤細胞增殖且效果顯著。并根據(jù)體外細胞毒實驗結(jié)果確定以質(zhì)量比為5∶5的人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物進行白癜風動物模型實驗。

根據(jù)黑色素易受強氧化劑破壞的特點,本實驗使用5%(體積分數(shù))過氧化氫以及7%(質(zhì)量分數(shù))氫醌制備白癜風動物模型,通過對比發(fā)現(xiàn)使用7%(質(zhì)量分數(shù))氫醌制備的動物模型模擬效果較好,這可能是由于過氧化氫與氫醌的脫色機制不同引起的。過氧化氫溶液中的HO2-離子能破壞色素的共軛雙鍵,是起到漂白作用的重要成分,目前無法得知過氧化氫能否對酪氨酸活性和黑色素的生成產(chǎn)生影響。而氫醌能夠抑制酪氨酸酶的生成,從而影響黑色素的合成[15-16]。因此本文認為過氧化氫只是對已經(jīng)生成的黑色素具有漂白作用,并不影響黑色素細胞生成黑色素;而氫醌能夠降低細胞生成黑色素的能力,在短時間內(nèi)造成白癜風樣皮膚改變。

實驗組豚鼠模型的皮膚上有大部分黑色素缺失,肉眼可觀察到動物皮膚均明顯變白,有的地方出現(xiàn)白斑且長出灰白色毛發(fā)。該模型在一定程度上能夠反映白癜風的主要病理特征,證明本實驗模型是成功的。通過喂食不同濃度人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3的組合物后,相較于模型對照組,實驗組的白癜風癥狀明顯減退,白斑白毛逐漸減少,且高劑量皂苷組合物的作用效果比低劑量皂苷組合物的作用效果更好。

4 結(jié) 論

本實驗通過體外細胞毒實驗研究不同濃度、不同比例的人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物、人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3對黑素瘤細胞 B16-F10的抑制率以及構(gòu)建動物模型實驗研究不同計量的人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3的組合物對白癜風動物模型的治療效果表明,該藥能在體外抑制黑素瘤細胞B16-F10的增長,能在白癜風動物模型中能減輕白癜風癥狀。人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物能使白癜風豚鼠模型血漿中的MAO值降低,CHE活力降低,TYR含量增加,說明人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg3組合物能明顯改善白癜風的病變,對白癜風有一定的治療作用且能增加黑色素的生成。