徐興堂，張子?xùn)|，王玉紅

(1.黑龍江省帶嶺林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江 帶嶺 153106 ;2.東北林業(yè)大學(xué) 森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

松科落葉松屬落葉松〔Larixgmelinii(Rupr.) Kuzen〕是我國東北林區(qū)的主要森林樹種，分布于大、小興安嶺海拔300～1 200m地帶，蘇聯(lián)遠(yuǎn)東地區(qū)也有分布，葉為倒披針狀條形(針葉)，富含精油[1]。植物精油是植物新陳代謝的此生產(chǎn)物，可以通過水蒸氣蒸餾法蒸餾等方法提取。松針是對松科常綠喬木針葉的統(tǒng)稱，可提取出精油。松針精油具有清香、果香、木香、藥草香，且具有抑菌、殺蟲等生物活性。

1 試驗(yàn)材料、儀器及試劑

興安落葉松鮮針葉( 采集自黑龍江省伊春市帶嶺區(qū)東山種子園)，纖維素內(nèi)切酶(濟(jì)寧和信技術(shù)有限公司)，纖維素外切酶(濟(jì)寧和信技術(shù)有限公司)，半纖維素酶(Sigma ，USA)，電子控溫，浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)，電子控溫加熱套(天津泰斯特儀器有限公司)，磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司)，三重四極桿串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent Technologies，USA)，紫外可見分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)，無水硫酸鈉(天津恒興化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鈉(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，冰醋酸(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(天津天力化學(xué)試劑有限公司)，羥甲基纖維素鈉(CMC)(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma，USA)，3，5-硝基水楊酸(DNS試劑)(上海季藍(lán)生物有限公司)，酒石酸鉀鈉 (天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，結(jié)晶酚(天津天力化學(xué)試劑有限公司)，醋酸鈉(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 酶活測定

吸取稀釋酶液(吸取1.0mL酶液，精確到0.01mL，準(zhǔn)確稀釋定容)與1.8mL 1%的CMC溶液加入具塞刻度試管混勻，50℃水浴加熱60min，水浴加熱完成后取出待其冷卻，加入DNS試劑2mL，搖勻后立即沸水浴加熱10min，冷卻后用蒸餾水定容至25mL；稀釋酶液中加入1.8mL醋酸緩沖溶液，不加入CMC其他步驟同上，作為空白用于調(diào)零，550nm下測OD值。平行3次測定取其平均值，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程得出含量，按式1計(jì)算酶活(U/g)[2]。

式1中：5.56為1mg葡萄糖的μmol數(shù)。

2.2 原料酶預(yù)處理及精油的提取

取100g自然干燥后粉碎的興安落葉松針葉放入2 000mL的蒸餾燒瓶中，按料液比1∶10加入蒸餾水，分為5組。5組分別為添加100U半纖維素酶組，纖維素內(nèi)切酶組，纖維素外切酶組，混合酶(半纖維素∶纖維素外切酶=1∶1)組及不添加任何酶組的對照空白組。將裝好的蒸餾燒瓶固定在50℃的恒溫水浴鍋中，攪拌60 min后，進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，即加熱至沸騰開始計(jì)時(shí)120min。獲得的精油冷卻至室溫，記錄體積。將精油裝入密封的玻璃瓶中，4℃保存，備用。進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算興安落葉松針葉精油得率。

2.3 興安落葉松針葉精油氣相質(zhì)譜(GC-MS)分析方法

安捷倫7000A三重四極桿串聯(lián)氣質(zhì)聯(lián)用儀氣相條件：色譜柱為HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)石英毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度280℃，初始柱溫50℃，以3℃/min升至140℃，保持10min，以15℃/min升至215℃，以5℃/min升至260℃，保持2min。載氣為高純氦氣，分流比為40∶1，進(jìn)樣量1μL。電子轟擊離子源(EI)溫度：230℃，接口溫度280℃，四級桿溫度150℃，掃描范圍30～500aum，溶劑延遲時(shí)間為3.75min。

2.4 酶輔助提取興安落葉松針葉精油

經(jīng)上述試驗(yàn)計(jì)算得到的不同酶預(yù)處理后提取興安落葉松針葉精油的得率，其最大值所對應(yīng)的酶用于單因素試驗(yàn)。酶解時(shí)間、酶解溫度和pH值是酶解過程中的重要因素，因此對其進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定酶解反應(yīng)的最佳條件。

2.4.1 酶解pH值。將100U的酶溶于pH分別為3、4、5、6的1 000mL水中，加入裝有100g興安落葉松針葉的蒸餾燒瓶中，于50℃水浴鍋中進(jìn)行酶預(yù)處理60 min，間歇攪拌。酶解后進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，120 min后油水分離，冷卻至室溫經(jīng)3 500 r/min離心10 min，取上層加入無水硫酸鈉脫水得興安落葉松針葉精油。平行測定3次，計(jì)算興安落葉松針葉精油得率，確定最適pH值。

2.4.2 酶解時(shí)間。將100U酶溶于pH值為5的1 000mL水中，加入裝有100g興安落葉松針葉的蒸餾燒瓶中，于50℃水浴鍋中進(jìn)行酶預(yù)處理，酶解時(shí)間分別選取為30min、60min、90min、120min，間歇攪拌。酶解后進(jìn)行水蒸氣蒸餾，120min后油水分離，冷卻至室溫經(jīng)3 500r/min離心10min，取上層加入無水硫酸鈉脫水得興安落葉松針葉精油。平行測定3次，計(jì)算興安落葉松針葉精油得率，確定酶解作用時(shí)間。

2.4.3 酶解溫度。將100U的酶溶于pH值為5的1000mL水中，加入裝有100g興安落葉松針葉的蒸餾燒瓶中，于30、40、50、60℃的恒溫水浴條件下進(jìn)行酶預(yù)處理90min，間歇攪拌。酶解后進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，120min后油水分離，冷卻至室溫經(jīng)3500r/min離心10min，取上層加入無水硫酸鈉脫水得興安落葉松針葉精油。平行測定3次，計(jì)算興安落葉松針葉精油得率，確定酶解作用溫度。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 酶的活力

對3種酶的酶活力的測定的結(jié)果為：半纖維素酶、纖維素外切酶和纖維素內(nèi)切酶的活力分別為2160.28U/g、2432.72U/g和2465.12U/g。

3.2 興安落葉松針葉精油的提取率

表1 不同酶預(yù)處理提取興安落葉松針葉精油量

由不同酶預(yù)處理提取興安落葉松針葉精油量(表1)可知：經(jīng)酶預(yù)處理的精油提取率為1.23%，酶輔助方法提取精油的量明顯增加。不同的酶預(yù)處理后提取精油量也有所差異，其中，混合酶的效果最好，提取率為1.70%，比對照提高了38.2%，可見興安落葉松針葉經(jīng)酶預(yù)處理后更有利于精油的提取。

3.3 興安落葉松針葉精油成分分析

由不同酶預(yù)處理后提取興安落葉松針葉精油的成分及含量(表2)與不同酶預(yù)處理后提取興安落葉松針葉精油成分(表3)可知：經(jīng)5種預(yù)處理后的興安落葉松針葉精油中被鑒定出33種成分、.其中含量大于1%的主要成分分別有24、23、24、24和24種，含量大于10%的主要成分分別有2、3、2、2和3種；采用峰面積歸一法計(jì)算所含各成分的相對含量百分比，精油中大于1%的主要成分89.117%、88.736%、89.752%、89.516%和90.406%。由此可見，酶預(yù)處理組與未經(jīng)酶預(yù)處理組比較，主要成分相差不大。

表2 不同酶預(yù)處理后提取興安落葉松針葉精油的成分及含量

注：A：未經(jīng)酶預(yù)處理，B: 經(jīng)半纖維素酶預(yù)處理， C：經(jīng)纖維素外切酶預(yù)處理， D：經(jīng)纖維素內(nèi)切酶預(yù)處理， E：經(jīng)混合酶(纖維素外切酶∶半纖維酶=1∶1)預(yù)處理。

表3 酶預(yù)處理后的興安落葉松針葉精油中主要成分的種類

注：A：未經(jīng)酶預(yù)處理， B：經(jīng)半纖維素酶預(yù)處理， C：經(jīng)纖維素外切酶預(yù)處理， D：經(jīng)纖維素內(nèi)切酶預(yù)處理， E：經(jīng)混合酶(纖維素外切酶∶半纖維酶=1∶1)預(yù)處理。

3.4 酶輔助提取興安落葉松針葉精油工藝優(yōu)化

3.4.1 pH值

由pH值對興安落葉松針葉精油得率的影響(圖1)可知：當(dāng)pH值=5時(shí)，興安落葉松針葉精油得率最高；當(dāng)pH值<5時(shí)，精油得率隨pH值的降低而降低；pH值>5時(shí)，精油得率隨pH值的增加而降低。這是由于混合酶的活性受到pH值的影響，pH = 5時(shí)混合酶可以最大限度的破環(huán)β-1，4糖苷鍵消溶細(xì)胞壁。由于細(xì)胞壁的損傷程度逐步提高，有效物質(zhì)溶出阻力降低，故此時(shí)興安落葉松針葉精油得率最高。

圖1 pH值對興安落葉松針葉精油得率的影響

3.4.2 酶解作用時(shí)間

由酶解時(shí)間對興安落葉松針葉精油得率的影響(圖2)可知：興安落葉松松針的酶解過程90min基本完成，當(dāng)酶解反應(yīng)在30～90min時(shí)，精油得率明顯上升，而在90min之后，精油得率無太大變化。因此，最佳酶解時(shí)間為90min。因酶解反應(yīng)必須持續(xù)一定的時(shí)間，但酶解時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致酶與溶出物發(fā)生了反應(yīng)或有效成分溶出受到酶解產(chǎn)物的阻礙，而使溶出率降低。

圖2 酶解時(shí)間對興安落葉松針葉精油得率的影響

3.4.3 酶解溫度

由酶解溫度對興安落葉松針葉精油得率的影響(圖3)可知：當(dāng)溫度<50℃時(shí)，精油得率隨著溫度的升高而增加，而當(dāng)溫度>50℃后，精油得率反而降低。因此，最佳酶解溫度為50℃。由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)大分子化合物，故溫度超過酶解最適溫度范圍就會(huì)使酶逐步變性，酶的立體構(gòu)象與活力位點(diǎn)發(fā)生改變使酶活力的下降或喪失，從而影響混合酶對興安落葉松針葉葉的酶解效果，不利于興安落葉松針葉精油的提取。

圖3 酶解溫度對興安落葉松針葉精油得率的影響

4 結(jié)論

4.1 本研究采用酶輔助-水蒸氣蒸餾法提取興安落葉松針葉精油。采用半纖維素、纖維素外切酶、纖維素內(nèi)切酶及混合酶(纖維素外切酶∶半纖維素酶=1∶1)對興安落葉松針葉預(yù)處理后提取其精油，其結(jié)果表明：混合酶組預(yù)處理后提取精油量最高，經(jīng)酶預(yù)處理的興安落葉松針葉精油提取率比未經(jīng)酶預(yù)處理組提高了38.2%，這對大規(guī)模工業(yè)化云杉精油的提取意義重大。經(jīng)過GC-MS分析，未經(jīng)酶預(yù)處理組與酶預(yù)處理組提取的興安落葉松針葉精油，在相同氣質(zhì)條件下，進(jìn)行分析鑒定，精油組成和主要成分含量未沒有明顯變化，這表明在精油得率提高的同時(shí)并未影響精油的品質(zhì)。

4.2 對提取興安落葉松針葉精油的預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行單因素試驗(yàn)研究，得到最佳提取工藝條件，當(dāng)pH值為5、酶解時(shí)間為90min、酶解溫度為50℃，興安落葉松針葉精油得率最高，為1.70%。提取工藝條件可靠，并可以為其它植物精油的提取提供新的方法和理論依據(jù)。