趙旭升 朱曉芳 吳 啟 沈仁芳?

（1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

（2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

磷作為一種維持植物生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素，不僅是植物體內(nèi)核酸、磷脂、腺苷三磷酸等重要化合物的組成成分，還以多種形式參與植物體內(nèi)的各項代謝活動［1］。然而，缺磷土壤在世界范圍內(nèi)廣泛分布，約占全球耕地面積的67%，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一大制約因素［2-3］。盡管多數(shù)低磷土壤中的總磷含量很高，可供植物直接吸收的有效磷含量卻很低，難以滿足植物的正常生長所需。這是由于來源于土壤和肥料中的磷易被土壤中的礦物和有機質(zhì)所固定，降低了它們的生物有效性［4］。

植物在經(jīng)歷了長期的演化過程后，形成了一系列的耐低磷機制。如通過改變根系構(gòu)型［5］、由根系向外分泌質(zhì)子或有機酸［6］以及與叢枝菌根共生［7］等措施來增強根系對土壤中難溶態(tài)磷的活化和吸收；或通過改變體內(nèi)的脂質(zhì)代謝途徑［8］、提高核糖核酸酶的活性［9］等手段提高對內(nèi)源磷的再利用能力。近年來的研究表明，在植物響應(yīng)缺磷脅迫的過程中，植物的細胞壁組分也參與了內(nèi)源磷的再利用：缺磷條件下的擬南芥，其細胞壁果膠和半纖維素含量均發(fā)生了顯著變化，暗示細胞壁組分可能參與了擬南芥對缺磷脅迫的響應(yīng)［10］；進一步的研究發(fā)現(xiàn)，水稻在缺磷條件下，根系細胞壁的果膠糖醛酸含量與根系中的可溶性磷水平存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，即水稻根系細胞壁中的果膠糖醛酸含量越高，其對細胞壁磷的再利用能力越強；體外實驗也表明，細胞壁中的果膠組分可通過吸附FePO4中的Fe3+，使部分PO43-游離出來，從而活化了細胞壁中的難溶態(tài)磷［11］。

細胞壁主要由果膠、半纖維素和纖維素構(gòu)成。與化學(xué)上相對惰性的纖維素及中性或略酸性的、可溶于堿的半纖維素不同，果膠富含同聚半乳糖醛酸（Homogalacturonan，HG）［12-13］。HG在高爾基體中合成時，C6位的羧基（-COOH）被果膠甲基轉(zhuǎn)移酶（Pectin methyltransferase, PMT）甲酯化，因此，運輸至細胞壁中的HG以高度（約75%）甲酯化的形式存在［14-15］。在植物的生長過程中，果膠的甲酯化度（Degree of methyl esterification,DE）會發(fā)生變化，這是由果膠甲酯酶（Pectin methylesterase, PME）控制的［16］。PME催化果膠中的HG去甲酯化，產(chǎn)生帶負電荷的羧基，同時釋放出甲醇和質(zhì)子［17］。

水稻根系細胞壁中的果膠含量與細胞壁磷的釋放密切相關(guān)［11］，但其中的具體作用機制尚不清楚，需要進一步的研究。本文選取粳稻品種Nipponbare（Nip）和秈稻品種Kasalath（Kas）作為試驗對象，研究了在缺磷條件下，水稻內(nèi)源磷可利用水平的變化及其差異，并探究了產(chǎn)生這種差異的具體原因，以期豐富水稻的耐低磷機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)條件

選取對內(nèi)源磷再利用能力有差異的水稻品種Nip和Kas為試驗材料［11］。

將水稻種子用蒸餾水浸泡24 h，然后移至帶有浮板的濾網(wǎng)上。將濾網(wǎng)置于0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液（pH 5.6）中，30℃避光培養(yǎng)3 d，使其生根發(fā)芽。然后將濾網(wǎng)移至木村（Kimura B）營養(yǎng)液中，在人工氣候室中培養(yǎng)，白天28℃/14 h，夜晚22℃/10 h，光照強度為450 μmol·m-2· s-1，相對濕度為60%。

處理方法：水稻發(fā)芽一周后，轉(zhuǎn)移至1.5 L黑色培養(yǎng)罐中木村營養(yǎng)液正常培養(yǎng)一周。然后選取生長一致的幼苗（Nip、Kas），分別用正常（+P，180 μmol·L-1）和缺磷（-P，0 μmol·L-1）的木村營養(yǎng)液（pH 5.6）培養(yǎng)一周，共得到四個處理（Nip+P、Nip-P、Kas+P、Kas-P）。所用營養(yǎng)液均用稀H2SO4和NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 5.6，每天更換一次。

1.2 可溶性磷的提取與測定

水稻可溶性磷的提取，按照Delhaize和Randall［18］的方法進行：用去離子水反復(fù)沖洗根系，再用吸水紙吸干水分，然后迅速剪下根系和地上部并稱重，塞入放置有氧化鋯珠的樣品管中，并用液氮冷凍。取出冷凍后的樣品管，置于組織研磨儀（凈信JXFSTPRP-24，上海）中粉碎，然后分別向根系和地上部中加入200 μL、400 μL的5 mol·L-1的H2SO4溶液。再次研磨均勻后，又分別加入4 mL和8 mL的去離子水，震蕩混勻。靜置20 min后，在3 000 r·min-1的條件下離心5 min（ThermoMicrocl17，德國）。

吸取100 μL上清液和磷標(biāo)準(zhǔn)液（0、10、20、30、40、50、75、100 mg·L-1）至1.5 mL離心管中，并加入100 μL鉬銻抗顯色劑和800 μL去離子水，混勻后在37℃下靜置30 min，用酶標(biāo)儀（Tecan, 瑞士）在880 nm處測定吸光度。

1.3 細胞壁的制備

將處理后的水稻根系剪下，根據(jù)Zhong和Lauchli［19］的方法提取細胞壁：首先將根系經(jīng)液氮冷凍，在研缽中研磨成粉末，然后加入5 mL 75%的乙醇溶液，洗入10 mL離心管中。室溫下靜置20 min后，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液。再分別加入5 mL的丙酮、甲醇︰氯仿(1︰1)和甲醇進行清洗，重復(fù)上述靜置、離心、棄上清液等步驟。最后得到的殘渣即為細胞壁，在烘箱中60℃烘干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細胞壁固著磷的提取與測定

稱取5 mg左右的細胞壁，按照Zhu等［11］的方法提取固著態(tài)磷：將細胞壁樣品置于1.5 mL離心管中，加入1 mL 2 mol·L-1的HCl溶液。渦旋振蕩24 h后，15 000 r·min-1的條件下離心5 min。上清液中磷即為細胞壁固著磷，磷的測定方法同上。

1.5 果膠提取及甲酯化度的測定

稱取5 mg左右的細胞壁，按照Yang等［20］的方法提取果膠組分。將細胞壁樣品置于1.5 mL離心管中，并加入1 mL去離子水。在沸水中煮1 h后，15 000 r·min-1的條件下離心5 min，吸取上清液至5 mL離心管中。向殘渣中繼續(xù)加入1 mL去離子水，重復(fù)提取兩次。混合所得的3 mL上清液即為果膠提取液。

果膠羧基含量的測定，根據(jù)Blumenkrantz和Asboehansen［21］提出的方法進行：吸取100 μL的果膠提取液和半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液（0、10、20、30、40、50、75、100 mg·L-1）至1.5 mL離心管中。然后加入500 μL含0.0125 mol·L-1硼砂（Na2B4O7·10H2O）的濃H2SO4。置于沸水中煮5 min后，立即置于冰上冷卻，2 min后迅速加入10 μL 0.15%的間羥基聯(lián)苯（M-hydro-diphenyl，溶于0.5%的NaOH溶液）。30℃下孵育20 min后，用酶標(biāo)儀在520 nm處測定吸光值。

果膠甲酯基含量的測定，根據(jù)Klavons和Bennett［22］的方法進行：吸取125 μL的果膠提取液，加入25 μL 4 mol·L-1的NaOH溶液，震蕩混勻。37℃下皂化30 min后，加入50 μL 2 mol·L-1的HCl溶液使其酸堿中和。向200 μL甲醇標(biāo)液（0、10、20、30、40、50、75、100 μmol·L-1）和水解樣品中加入400 μL 200 mmol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.5）、0.01 units·μL-1乙醇氧化酶（Alcohol oxidase，AO，Sigma）。30℃下孵育10 min后，加入800 μL 5 g·L-1的巰基拉曼染料（Purpald，4-氨基-3-肼基-5-巰基-1, 2, 4-三唑,4-anmino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole,Sigma，溶于0.5 mol·L-1的NaOH溶液），30℃下孵育30 min后，用酶標(biāo)儀在550 nm處測定吸光值。

果膠甲酯化度（DE，%）=甲酯基含量/（羧基含量+甲酯基含量）×100。

1.6 果膠甲酯酶的提取及活性測定

剪取生長三周的水稻幼苗根系，用來提取果膠甲酯酶。根系樣品經(jīng)液氮冷凍后，用組織研磨儀粉碎。然后加入500 μL提取液（1 mol·L-1NaCl，10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.5），在冰上孵育30 min，期間振蕩3次。隨后在15 000 r·min-1條件下離心5 min，所得上清液即為待測樣品［23-24］。

果膠甲酯酶活性的測定，參照A n t h o n和Barrett［25］的方法進行：吸取100 μL樣品和甲醇標(biāo)液（0、10、20、30、40、50、75、100 μmol·L-1）至1.5 ml離心管中，加入200 μL 200 mmol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.5）、0.64 mg·mL-1果膠（DE=90%，Sigma）、0.01 units·μL-1AO。振蕩混勻后，在5 000 r·min-1下離心10 s，30℃孵育10 min。然后加入400 μL 5 g·L-1的巰基拉曼染料，振蕩混勻。30℃孵育30 min后，用酶標(biāo)儀在550 nm處測定吸光值。

1.7 體外磷解析實驗

將50 mg不同甲酯化度的果膠溶于30 mL水中，再分別加入30 mg FePO4·2H2O，置于37℃搖床（ZWY-2102C，智城，上海）中震蕩24 h。3 000 r·min-1條件下離心5 min后，用鉬銻抗比色法測定上清液中的磷含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和繪圖在Microsoft Excel 2016軟件中進行，并采用SAS 8.1統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析和多重比較，并用最小顯著性差異（LSD）法檢驗處理間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 缺磷處理后水稻體內(nèi)可溶性磷含量的變化

為了探究水稻在缺磷后內(nèi)源磷可利用水平的變化，對Nip和Kas兩個水稻品種進行不同時間的缺磷處理，分別測定了地上部和根系中的可溶性磷含量。由圖1A可知，隨著缺磷時間的延長，Nip和Kas體內(nèi)的可溶性磷含量均不斷下降。根系中的可溶性磷含量在下降5 d后趨于穩(wěn)定，而地上部的磷下降趨勢明顯滯后，且在缺磷第7天仍有下降趨勢。

總體而言，兩個品種的可溶性磷含量的變化趨勢基本一致，但Nip體內(nèi)的可溶性磷含量均一直高于Kas。為了比較兩個品種間的差異，選取了處理7 d后的樣品進行分析。由圖1B可知，正常處理7 d時，在地上部和根系中，Nip中的可溶性磷含量均顯著高于Kas；缺磷處理7 d后，可溶性磷含量均顯著下降，而Nip仍顯著高于Kas。

2.2 缺磷處理后細胞壁固著磷含量的變化

由圖2可知，缺磷處理7 d后，Nip和Kas根系細胞壁固著磷含量均顯著下降，且達到相同水平。但由于正常處理時，Nip根系細胞壁的固著磷含量顯著高于Kas，說明Nip在缺磷處理后，較Kas從根系細胞壁中釋放出了更多的磷。

2.3 果膠甲酯化度與其水解難溶態(tài)磷能力的關(guān)系

圖1 缺磷處理水稻體內(nèi)可溶性磷含量的變化Fig. 1 Variation of soluble P in rice shoot and root in treatment for one week

圖2 缺磷處理一周后水稻根系細胞壁固著磷含量Fig. 2 Cell wall absorbed Pi in rice root after one week of -P treatment

Zhu等［11］通過果膠的體外解析實驗，證明了果膠溶液能從難溶態(tài)的FePO4中釋放出更多的Pi。而果膠在植物中是以不同甲酯化度存在的，為了探究果膠釋放難溶態(tài)磷的能力與其甲酯化度之間的關(guān)系，本文選取了三種不同甲酯化度的果膠，進行了同樣的體外磷解析實驗。圖3的結(jié)果顯示，隨著甲酯化度的降低，果膠從FePO4中釋放出的無機磷（Pi）顯著增加。這表明，果膠釋放難溶態(tài)磷的能力與其甲酯化度呈負相關(guān)關(guān)系。

2.4 不同品種水稻缺磷處理后果膠甲酯化度的變化

為了探究兩個水稻品磷再利用能力的差異是否與其甲酯化度的變化有關(guān)，測定了根系中細胞壁的果膠甲酯化度。由圖4可知，正常培養(yǎng)時，Nip和kas根系中的果膠甲酯化度無顯著差異。在缺磷處理7 d后，Nip根系中的果膠甲酯化度無明顯變化，而kas根系中的果膠甲酯化度顯著升高。

圖3 不同甲酯化度的果膠釋放出的磷含量Fig. 3 Pi content released by pectin relative to degree of methyl esterification of the pectin

圖4 缺磷處理一周后水稻根系的果膠甲酯化度Fig. 4 Methyl esterification degree of pectin in rice root after one-week of -P treatment

2.5 不同品種水稻缺磷處理后果膠甲酯酶活性的變化

為了探究缺磷處理后兩個水稻品種的根系果膠甲酯化度發(fā)生不同變化的原因，又測定了水稻根系中與之相關(guān)的果膠甲酯酶（PME）活性。由圖5可知，盡管Kas的PME活性在+P/-P處理后均顯著高于Nip，但在+P/-P處理間無顯著差異，而Nip在-P處理后PME活性顯著升高。

3 討 論

圖5 +P/-P處理一周后水稻根系的果膠甲酯酶活性Fig. 5 Pectin methylesterase (PME) activity of rice root after one week of -P treatment

作為植物抵御外界不良環(huán)境的第一道屏障，細胞壁不僅在植物緩解鋁毒、鎘毒的過程中發(fā)揮著重要作用［26-29］，其在植物應(yīng)對缺磷脅迫中所起的作用也逐漸受到關(guān)注。早在 1965 年，Hsu［30］就發(fā)現(xiàn)，細胞壁能通過吸附Al3+/Fe3+進而吸附土壤中的磷，將磷以諸如 Al(OH)2H2PO4的形式結(jié)合于細胞壁上。根據(jù)Ae等［31］的報道，與高粱和大豆等作物相比，花生能從低磷土壤中吸收更多的磷。而這種能力的差異，無法用根系的構(gòu)型變化或根系分泌物的產(chǎn)生來解釋。進一步研究發(fā)現(xiàn)，花生和開花前的木豆，其根系細胞壁表現(xiàn)出更高的難溶態(tài)磷溶解活性，為高粱和大豆的兩倍，而這或許是它們能從低磷土壤中吸收更多磷的原因。由于這種新的土壤磷活化機制，發(fā)生在根系與土壤顆粒的交界面，而被稱為“接觸反應(yīng)（Contact reaction）”［32］。Zhu等［11］通過體外實驗證明，細胞壁中的果膠組分可通過吸附FePO4中的Fe3+，使部分PO43-游離出來，從而活化難溶態(tài)磷。本次實驗進一步表明，果膠活化難溶態(tài)磷的能力與其甲酯化度有關(guān)。由圖3可知，隨著甲酯化度的降低，果膠從FePO4中釋放出的Pi顯著增加。

除此之外，植物的細胞壁組分還參與了根系中內(nèi)源磷的再利用過程。Zhu等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，與水稻品種Kas相比，Nip體內(nèi)磷的可利用水平較高。在缺磷處理5周后，Nip根系中的可溶性磷含量仍高于Kas，而這可能與細胞壁磷的釋放有關(guān)。本文也將這兩個品種進行了一周的缺磷處理，測定了水稻體內(nèi)可溶性磷含量的動態(tài)變化。在缺磷脅迫下，水稻體內(nèi)的可溶性磷含量迅速下降，而Nip根系和地上部中的可溶性磷含量均一直高于Kas（圖1B）。此外，在缺磷處理7 d后，Nip和Kas的細胞壁磷均顯著降低至同一水平（圖2），但Nip在此期間釋放出了83%的細胞壁磷，而秈稻Kas僅釋放出了76%的細胞壁磷，說明粳稻Nip的內(nèi)源磷再利用水平更高。

Zhu等［11］通過對缺磷處理后多個品種的回歸分析表明，水稻根系中可溶性磷含量與其根系細胞壁中果膠含量之間成正相關(guān)關(guān)系，而與其中的半纖維素及纖維素含量無關(guān)。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，植物激素乙烯及信號分子NO、H2S均可通過提高水稻根系細胞壁中的果膠含量以及果膠甲酯酶的活性來提高細胞壁磷的釋放，從而增加缺磷條件下水稻體內(nèi)的可溶性磷含量［33-36］。植物細胞壁中的果膠組分主要在高爾基體中形成，此時形成的果膠因為高度的甲酯化而帶有少量的負電荷，因此，與陽離子的結(jié)合能力較弱［16］。高度甲酯化的果膠經(jīng)過分泌進入細胞壁后，在果膠甲酯酶的催化下將甲酯基水解，暴露出了其中的羧基（-COOH），從而增加了對細胞壁中陽離子（如FePO4中的Fe3+）的吸附，使得與之結(jié)合的PO43-釋放出來，供植物再利用。在缺磷處理后，粳稻Nip根系中的PME活性升高了31%（P＜0.05，圖5），維持了較低的果膠甲酯化度（圖4），即是維持了較高的難溶態(tài)磷活化能力，從而釋放出了更多的細胞壁磷（圖2）。而缺磷脅迫下的秈稻Kas，其根系中的PME活性卻未發(fā)生顯著變化（圖5），從而不能將果膠有效地去甲酯化，進而導(dǎo)致細胞壁中果膠甲酯化度升高了25%（P＜0.05，圖4），使其活化難溶態(tài)磷的能力降低。

4 結(jié) 論

缺磷處理后，水稻體內(nèi)的可溶性磷含量迅速降低，而與根系相比，地上部的下降趨勢明顯滯后。缺磷脅迫下，Nip根系和地上部中可溶性磷含量均一直高于Kas，而直到缺磷7 d后，Nip根系和地上部中可溶性磷含量均仍顯著高于Kas。此外，在缺磷處理后，Nip和Kas的細胞壁磷均顯著降低，但Nip釋放出了更多的細胞壁磷。說明Nip的內(nèi)源磷再利用水平高于Kas。進一步的體外解析實驗表明，低甲酯化度的果膠具有更強的活化難溶態(tài)磷的能力。而與同在缺磷條件下的Kas相比，Nip可以通過提高其根系中的PME活性，來維持其細胞壁中的果膠甲酯化度處于相對較低水平，即是維持了較高的難溶態(tài)磷活化能力，從而將細胞壁磷更多地轉(zhuǎn)化為可溶性磷。