王夢琪，邵晨陽，朱蔭，張悅，林智*，呂海鵬*

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龍井茶香氣成分的產(chǎn)區(qū)差異分析

王夢琪1,2，邵晨陽3，朱蔭1，張悅1，林智1*，呂海鵬1*

1. 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3. 河南茶葉工程技術(shù)研究中心，信陽農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 信陽 464000

龍井茶是我國典型的地理標(biāo)志茶類產(chǎn)品，其產(chǎn)地分為西湖產(chǎn)區(qū)、錢塘產(chǎn)區(qū)及越州產(chǎn)區(qū)3個產(chǎn)區(qū)。采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME/GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，分析比較了西湖產(chǎn)區(qū)、錢塘產(chǎn)區(qū)及越州產(chǎn)區(qū)3個不同產(chǎn)區(qū)的一批次代表性龍井茶的香氣成分組成特點及其相對含量水平等。結(jié)果表明，不同產(chǎn)區(qū)龍井茶的香氣成分在化學(xué)組成上存在一些差異，分別從錢塘產(chǎn)區(qū)、越州產(chǎn)區(qū)、西湖產(chǎn)區(qū)的龍井茶樣品中鑒定出了47種、45種和40種共同香氣成分；此外，基于龍井茶香氣成分的相對含量建立了1個PLS-DA模型（擬合參數(shù)為2=0.885，2=0.777），可區(qū)分3個不同產(chǎn)地的龍井茶樣品；通過數(shù)據(jù)處理軟件查明了龍井茶中的12種關(guān)鍵香氣成分在3個不同產(chǎn)區(qū)中的分布規(guī)律。

龍井茶；香氣；產(chǎn)區(qū)；差異；分析

龍井茶是我國傳統(tǒng)的歷史名茶之一，以“色翠、香郁、味醇、形美”四絕而馳名中外，尤其是其香氣品質(zhì)高鮮清幽，清香顯著，長期以來備受消費者的青睞[1-3]。香氣是鑒定茶葉品質(zhì)最重要的評價因子之一，是由性質(zhì)不同、含量微少且差異懸殊的眾多揮發(fā)性物質(zhì)組成的混合物。所謂茶香，實際是不同芳香物質(zhì)以不同濃度組合，并對嗅覺神經(jīng)綜合作用所形成的茶葉特有香型[4-6]。

龍井茶是我國典型的地理標(biāo)志茶類產(chǎn)品，是浙江省的著名特產(chǎn)。地理標(biāo)志產(chǎn)品龍井茶（GB/T 18650—2008）[7]指出，龍井茶地理標(biāo)志產(chǎn)品保護范圍限于國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫行政主管部門根據(jù)《地理標(biāo)志產(chǎn)品保護規(guī)定》批準的范圍，可分為西湖產(chǎn)區(qū)、錢塘產(chǎn)區(qū)及越州產(chǎn)區(qū)3個產(chǎn)區(qū)。長期的生產(chǎn)實踐表明，產(chǎn)區(qū)差異在很大程度上決定了龍井茶的香氣品質(zhì)差異。

現(xiàn)有研究在龍井茶香氣成分的產(chǎn)區(qū)差異方面涉及很少，以往研究[8-9]分析龍井茶香氣的富集方法一般采用同時蒸餾萃取法（SDE）。采用SDE方法雖然可得到濃度很高的香氣物質(zhì)，但獲得的香精油在感官上已與原茶香型有明顯區(qū)別[10]，提取得到的香精油香氣在一定程度上失真[9]。究其原因，可能是由于茶葉香氣提取過程中長時間的高溫作用，致使某些物質(zhì)發(fā)生變化，特別是對熱敏性的香氣組分影響較大，例如不飽和脂肪酸氧化降解生成一些脂肪族醇、醛物質(zhì)，糖苷類化合物水解釋放出芳樟醇、香葉醇等物質(zhì)，-胡蘿卜素?zé)峤到馍?紫羅酮等物質(zhì)等等。相比SDE法，頂空-固相微萃?。℉S-SPME）是一種無溶劑的樣品處理技術(shù)，具有成本低、無需有機溶劑、所需樣品量少、靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡單、方便快捷的特點，能較準確地反映樣品的風(fēng)味組成，并能方便地與氣相色譜、液相色譜聯(lián)用，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于茶葉香氣成分分析[11-13]，并取得了較好的研究成果。例如，HS-SPME與氣相色譜-嗅聞技術(shù)（Gas Chromatography- Olfactometry，GC-O）聯(lián)用可以有效分析茶葉中的特征香氣成分[14-15]，另外HS-SPME與手性色譜聯(lián)用分析茶葉中的揮發(fā)性萜類化合物的對映異構(gòu)體等[16-17]。

為查明地理標(biāo)志范圍內(nèi)西湖產(chǎn)區(qū)、錢塘產(chǎn)區(qū)及越州產(chǎn)區(qū)3個產(chǎn)區(qū)龍井茶香氣成分的產(chǎn)區(qū)差異，本研究選用一批具有代表性的龍井茶樣品，采用HS-SPME/GS-MS技術(shù)分析它們的香氣成分組成特點及含量水平等，進而分析香氣組成及含量上的產(chǎn)地差異規(guī)律等，以期為龍井茶的產(chǎn)區(qū)判別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要分析儀器

試驗材料為代表性龍井茶樣品15個（編號S1—S15），由浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心提供，其中錢塘產(chǎn)區(qū)和越州產(chǎn)區(qū)的樣品為2016年龍井茶實物參考樣（征求意見樣），西湖產(chǎn)區(qū)的龍井茶樣品為實物標(biāo)準樣；具體信息詳見表1所示。

主要分析儀器如下：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，型號：Agilent 7890A-5975C（美國Agilent公司）；色譜柱選用DB-5MS（30?m×250?μm×0.25?μm）；萃取頭為50/30?μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯涂層纖維（DVB/CAR/ PDMS）萃取頭（美國Supelco公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；PL202-L-電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 香氣分析方法

采用HS-SPME富集香氣成分[12]。準確稱取樣品1.00?g置于250?mL頂空萃取瓶中，加入10.0?mL沸水沖泡，放入60℃水浴鍋平衡5.0?min，然后插入裝有DVB/CAR/PDMS萃取頭（試驗前先將此萃取頭在GC-MS進樣口250℃老化30?min）的手動SPME手柄在60℃水浴條件下頂空萃取，萃取時間為60?min，取出后立即插入GC-MS進樣口中解吸附3.0?min。

表1 龍井茶樣品信息

GC-MS條件：進樣口及傳輸線溫度：280℃和270℃；載氣：氦氣；不分流進樣。升溫程序：先由60℃保持3.0?min，以4.0℃·min-1升至280℃，保持2.5?min；總分析時間為60.5?min。

質(zhì)譜：E1電離能量：-70?eV；質(zhì)量掃描范圍：33~600?u；離子源溫度：220℃。

由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計算機在NIST98.L標(biāo)準譜庫的檢索，查對有關(guān)質(zhì)譜資料，對基峰、質(zhì)核比和相對豐度等方面進行分析；進而結(jié)合揮發(fā)性成分的保留時間，保留指數(shù)以及采用標(biāo)準品驗證等方式，分別對各峰所代表的香氣物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和名稱加以確認，其相對含量采用峰面積歸一法分析，即以各組分的峰面積占總峰面積的百分比表示。

每個樣品獨立重復(fù)檢測3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)分析；關(guān)鍵香氣成分的判別使用SIMCA-P 11.5軟件進行分析[18]；關(guān)鍵香氣成分在龍井茶不同產(chǎn)區(qū)中的分布規(guī)律使用Multi Experiment Viewer （MeV）生物信息學(xué)分析軟件中的層序聚類分析（HCA）[19]完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)龍井茶樣品的香氣成分分析

3個不同產(chǎn)區(qū)龍井茶香氣成分的GC-MS總離子流圖如圖1所示。從錢塘產(chǎn)區(qū)、越州產(chǎn)區(qū)、西湖產(chǎn)區(qū)的龍井茶樣品中分別鑒定出47、45及40種共同香氣成分（表2）。

在錢塘產(chǎn)區(qū)樣品鑒定出的47種共性香氣成分中（表2），芳樟醇、()-己酸-3-己烯酯、()-丁酸-3-己烯酯及壬醛是相對含量最高的4種香氣成分，它們的相對含量分別為8.84%、8.45%、3.27%和2.14%。根據(jù)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點，對上述47種香氣成分進行分類分析，發(fā)現(xiàn)在錢塘產(chǎn)區(qū)龍井茶樣品的香氣成分中，有醇類11種（總計17.25%），酯類物質(zhì)6種（總計16.81%），碳氫化合物19種（總計11.74%），醛類物質(zhì)4種（總計4.43%），酮類物質(zhì)4種（總計4.03%），酚類化合物1種（0.92%），雜環(huán)化合物1種（0.37%），酸類物質(zhì)1種（0.62%）。

在越州產(chǎn)區(qū)樣品中所鑒定出的45種共性香氣物質(zhì)中（表2），()-己酸-3-己烯酯、芳樟醇、正辛醇、叔丁基乙酸乙酯及()-丁酸-3-己烯酯是相對含量最高的5種香氣成分，它們的相對含量分別達到8.93%、8.29%、3.91%、3.71%和3.26%。對上述45種香氣成分進行分類分析，表明在越州產(chǎn)區(qū)龍井茶樣品的香氣成分中，有酯類物質(zhì)7種（總計21.81%），醇類物質(zhì)9種（總計17.14%），碳氫化合物14種（總計9.57%），醛類物質(zhì)5種（總計5.46%），酮類物質(zhì)4種（總計4.59%），酚類化合物2種（總計1.69%），雜環(huán)化合物3種（總計1.42%），酸類化合物1種（0.83%）。

在西湖產(chǎn)區(qū)樣品中鑒定出的40種共性香氣成分中（表2），()-己酸-3-己烯酯、芳樟醇、()-丁酸-3-己烯酯、茉莉酮以及香葉醇是相對含量最高的5種成分，它們的相對含量分別為18.10%、6.29%、4.46%、2.43%和2.41%。對上述40種香氣成分進行分類分析表明，在西湖產(chǎn)區(qū)龍井茶樣品的香氣成分中，有酯類物質(zhì)8種（總計29.07%），醇類物質(zhì)6種（總計12.14%），碳氫化合物12種（占總計11.06%），酮類物質(zhì)4種（總計4.36%），醛類物質(zhì)5種（總計3.23%），酚類化合物2種（占1.40%），雜環(huán)化合物2種（總計1.50%），酸類物質(zhì)1種（1.43%）。

由上可見，本文所分析的錢塘產(chǎn)區(qū)、越州產(chǎn)區(qū)及西湖產(chǎn)區(qū)3個不同產(chǎn)區(qū)龍井茶樣品的香氣成分在化學(xué)組成上存在一定的差異（圖2）。西湖產(chǎn)區(qū)龍井茶樣品香氣成分中酯類成分的含量最高，越州產(chǎn)區(qū)次之，錢塘產(chǎn)區(qū)最低；而在醇類成分的相對含量上卻呈現(xiàn)出了相反的規(guī)律，即錢塘產(chǎn)區(qū)最高，越州產(chǎn)區(qū)次之，西湖產(chǎn)區(qū)最低；另外，3個產(chǎn)區(qū)龍井茶樣品的香氣成分中，酮類化合物的相對含量比較接近，為4.3%左右；西湖產(chǎn)區(qū)龍井茶樣品香氣成分中醛類成分較低，低于越州產(chǎn)區(qū)和錢塘產(chǎn)區(qū)；而越州產(chǎn)區(qū)的碳氫化合物成分較低，低于錢塘產(chǎn)區(qū)和西湖產(chǎn)區(qū)；錢塘產(chǎn)區(qū)的雜環(huán)化合物、酸類及酚類化合物成分較低，都低于越州產(chǎn)區(qū)和西湖產(chǎn)區(qū)。

2.2 不同產(chǎn)區(qū)龍井茶關(guān)鍵香氣成分的判別和聚類分析

本研究采用SIMCA-P 11.5軟件對香氣檢測結(jié)果進行分析，基于龍井茶香氣成分的相對含量建立了1個PLS-DA模型（擬合參數(shù)為2=0.885，2=0.777）。通過PLS-DA模型有效區(qū)分了3個產(chǎn)區(qū)的龍井茶樣品，發(fā)現(xiàn)對產(chǎn)區(qū)區(qū)分影響較大的12種關(guān)鍵香氣成分（VIP>1），分別是二氫芳樟醇、己酸己酯、苯甲醇、十三烷、()-己酸-3-己烯酯、反式2-己烯基己酸、香葉基丙酮、-紫羅酮、甲基(2)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸酯、十四烷、2,3-二氫-2,2,6-三甲基苯甲醛和癸醛。PLS-DA得分圖如圖3-A所示。由PLS-DA驗證模型可見（圖3-B），2回歸直線與Y軸的截距均小于0，表明該PLS-DA判別模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型較為可靠（2=0.286，2=－0.281）。PLS-DA分析是基于偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）回歸的一種判別方式，PLS-DA為有監(jiān)督的分析，人為加入了分組變量，可彌補PCA方法的不足，強化組間的差異。PLS-DA變量重要性因子（Variable Important for the Projection，VIP）值可以量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻，VIP值越大，變量在不同產(chǎn)地間差異越顯著。

為了直觀地展示12種關(guān)鍵香氣成分在3個不同產(chǎn)區(qū)間的分布規(guī)律，采用層序聚類分析（HCA）對這些關(guān)鍵香氣成分進行了分析（圖4），圖中顏色越深表示含量越多，顏色越淺含量越少。由圖4可知，這12種關(guān)鍵香氣成分的分布大概可分為3組。其中十三烷、己酸己酯、()-己酸-3-己烯酯和反式2-己烯基己酸這4種香氣成分主要在西湖產(chǎn)區(qū)龍井茶中含量最高；十四烷、苯甲醇、2,3-二氫-2,2,6-三甲基苯甲醛和-紫羅酮這4種香氣成分在越州產(chǎn)區(qū)龍井茶中含量最高；而二氫芳樟醇、香葉基丙酮、甲基(2)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸酯和癸醛這4種香氣成分在錢塘產(chǎn)區(qū)龍井茶中含量最高。

3 討論

香氣是決定茶葉品質(zhì)的重要因子。本研究分別從錢塘產(chǎn)區(qū)、越州產(chǎn)區(qū)、西湖產(chǎn)區(qū)的龍井茶樣品中鑒定出47、45和40種共性香氣成分，通過比較發(fā)現(xiàn)3個不同產(chǎn)區(qū)龍井茶的香氣成分在化學(xué)組成上也存在較大差異，這一點與以往的研究結(jié)果相似[8-9]，都證實了龍井茶香氣成分的產(chǎn)區(qū)差異性。然而因香氣富集方式的不同，研究結(jié)果也存在較多的差異。例如，張新亭等[8]采用SDE-GC/MS研究表明，與錢塘產(chǎn)區(qū)和越州產(chǎn)區(qū)龍井茶相比，西湖產(chǎn)區(qū)龍井茶香氣組分的數(shù)量較多、香氣含量較高，尤其是芳樟醇、己酸葉醇酯、-紫羅蘭酮、橙花叔醇等9種重要香氣組分的含量較高；孫彥等[9]采用SDE-GC/MS比較了6種龍井茶（西湖龍井商品1、西湖龍井商品2、西湖龍井評比優(yōu)質(zhì)品、龍井村、錢塘、龍塢）的香氣成分，研究表明，這6個龍井茶樣的香氣總量和成分含量差距較大，以龍井村產(chǎn)區(qū)的龍井茶香氣總量最多，錢塘和龍塢香氣總量相對較少，6種茶共有成分有18種，但各自含量不同，每種茶中發(fā)現(xiàn)有其他茶中不含有的特征成分。然而，代毅等[20]采用SPME-GC/MS研究表明，西湖、越州、錢塘3個不同產(chǎn)區(qū)的龍井茶的香氣物質(zhì)構(gòu)成種類基本一致，芳樟醇、丁酸-反-3-己烯酯、異戊酸-順-3-己烯酯等19種揮發(fā)性成分是龍井茶中的主要香氣成分，對構(gòu)成其特征風(fēng)味成分具有重要作用；鑒于該研究中所使用的龍井茶樣品量很少，每個產(chǎn)區(qū)僅1個樣品，因此有必要增加樣本量進行確認。

圖1 不同產(chǎn)區(qū)龍井茶揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流圖

表2 不同產(chǎn)區(qū)龍井茶的香氣成分及其相對含量

續(xù)表2

注：表中ND表明相對含量數(shù)據(jù)低于檢測限。

Note: ND in the table indicated the relative content was not detected in this study.

注：（A）PLS-DA得分圖；（B）PLS-DA驗證模型。

Note: (A) Score plot of PLS-DA, (B) Validate model of PLS-DA.

圖3 不同產(chǎn)區(qū)龍井茶香氣成分PLS-DA得分圖及其驗證模型

Fig.3 Score plot and validate model of PLS-DA of aroma components in Longjing teas of different regions

注：A：醇類；B：醛類；C：酮類；D：酯類；E：碳氫化合物；F：酚類化合物；G：酸類；H：雜環(huán)化合物。

圖4 不同產(chǎn)區(qū)龍井茶關(guān)鍵香氣成分熱圖

不同產(chǎn)區(qū)龍井茶香氣成分差異的原因，可能主要與不同產(chǎn)區(qū)龍井茶種植的地理環(huán)境（例如不同的微域氣候和土壤條件等）的差異有關(guān)。正是因為香氣組成和含量上的差異，使龍井茶的產(chǎn)區(qū)判別具有可能性。本研究基于龍井茶香氣成分的相對含量，建立了1個PLS-DA模型可初步區(qū)分3個不同產(chǎn)區(qū)的龍井茶樣品。以往有研究表明，電子鼻技術(shù)在龍井茶產(chǎn)地判別中有一定的應(yīng)用潛力，可采用首先利用電子鼻進行等級劃分，然后在同一等級下進行樹種鑒定和產(chǎn)地判別的西湖龍井茶品質(zhì)智能嗅覺快速檢測策略[21]；另外，有研究指出，鑒于茶葉中元素組成因氣候條件和土壤類型不同而有所差異，形成茶葉產(chǎn)地的元素指紋，因此不同產(chǎn)區(qū)龍井茶的礦質(zhì)元素指紋結(jié)合化學(xué)計量學(xué)工具可以有效對龍井茶產(chǎn)地進行溯源，其中FLDA和OPLS-DA模型較適合龍井茶產(chǎn)地溯源[22]。

受代表性樣品樣本量的限制，本研究初步分析了龍井茶香氣成分的產(chǎn)區(qū)差異。但因為茶葉香氣成分的含量和組成會受到眾多條件的影響，例如土壤、肥料、采摘標(biāo)準和加工方式等，后續(xù)研究需要盡可能擴大樣品量選取更多的代表性樣品進行分析，再通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析才能得到更好的趨勢性的研究結(jié)論。另外，茶葉香氣成分在總體上是微量物質(zhì)，前處理中香氣富集的方式對于后續(xù)分析也十分重要，不同的富集方式對分析結(jié)果往往影響很大。

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Aroma Constituents of Longjing Tea Produced in Different Areas

WANG Mengqi1,2, SHAO Chenyang3, ZHU Yin1, ZHANG Yue1, LIN Zhi1*, LYU Haipeng1*

1. Key Lab of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Henan Tea Engineering Research Center, Xinyang City Academy of Agricultural Science, Xinyang 464000, China

Longjing tea is one of the most famous traditional tea and a typical product of geographical indication in China. In this study, the composition and relative contents of aroma components in a representative batch of Longjing tea samples of 3 different origins, namely Xihu region, Yuezhou region, and Qiantang region, were analyzed by headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME/GC-MS). Results showed that there were some differences in the composition of aroma components among the three different regions, and 47, 45 and 40 common aroma components were identified in the tea samples from Qiantang region, Yuezhou region, and Xihu region, respectively. Moreover, Longjing tea samples from three different regions had been distinguished successfully using PLS-DA model (fitting parameters:2=0.885 and2=0.777)which was established basing on the relative contents of aroma components. The distributions of12 key aroma components in different areas were elucidated by the data processing software.

Longjing tea, aroma, producing areas, difference, analysis

TS272.5

A

1000-369X(2018)05-508-10

2018-01-02

2018-03-10

國家自然科學(xué)基金（31470694）、浙江省“三農(nóng)六方”科技協(xié)作項目（CTZB-F150922AWZ-SNY1-14）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-23）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）

王夢琪，女，碩士研究生，研究方向為茶葉加工品質(zhì)化學(xué)。

lvhaipeng@tricaas.com，linz@tricaas.com