王圣娣，熊 莉，郭 艷

(1. 鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學院附屬醫(yī)院 口腔科，湖北 黃石 435000；2. 中國醫(yī)科大學第四醫(yī)院 口腔科，遼寧 沈陽 110000)

舌鱗狀細胞癌(簡稱舌癌，tongue squamous cell carcinoma，TSCC)作為口腔科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1]，由于該腫瘤生長快、侵襲力強，多數(shù)患者臨床確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，是導致患者預后不佳的主要因素[2]，近年來雖然臨床診療手段不斷進步，但患者5年生存率提高有限[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，TSCC發(fā)生進展涉及多個癌基因或抑癌基因。但其具體發(fā)生機制尚未完全清楚。因此，深入探討TSCC發(fā)生的分子機制對改善患者預后具有重要意義。絲氨酸蛋白酶抑制因子A類3(serpin peptidase inhibitor clade A member 3，SERPINA 3)作為絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族重要成員，是一種急性炎癥反應(yīng)蛋白，在炎癥反應(yīng)及細胞增殖、凋亡、黏附等過程中發(fā)揮重要作用[5]，與多種惡性腫瘤發(fā)生及進展關(guān)系密切[6]。本研究擬檢測TSCC組織中SERPINA 3蛋白表達，探討其與臨床病理特征之間的關(guān)系及對預后的影響，以期為TSCC機制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年3月～2012年4月在黃石中心醫(yī)院口腔科擇期行手術(shù)治療的63例TSCC患者，均經(jīng)術(shù)后病理學檢查確診，術(shù)前均未行放化療治療。其中，男性38例，女性25例，年齡41～76歲，平均年齡(53.7±10.2)歲，分化程度：低分化7例，中分化36例，高分化20例；TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期23例，Ⅲ期17例，Ⅳ期11例；發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。同期留取45例因舌外傷或舌部良性病變行手術(shù)切除的正常舌黏膜組織作為對照，其中男性25例，女性20例，年齡38～75歲，平均年齡(52.5±9.8)歲，兩組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均衡可比。所有入選對象均由同一醫(yī)院同一組醫(yī)師完成手術(shù)操作。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均行知情同意。

1.2 主要試劑和設(shè)備 免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，兔抗人SERPINA 3多克隆抗體購自美國Abcam公司，總RNA提取試劑盒(Trizol法)購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自美國Promega公司，SERPINA 3和內(nèi)參引物均由上海生工生物公司設(shè)計合成，實時熒光定量PCR儀購自德國AJ公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測TSCC和對照組的組織中SERPINA 3蛋白表達 分別將TSCC和對照組的組織用甲醛固定，石蠟包埋，切片，厚度約3 μm，脫蠟，梯度乙醇至水，置于10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，95℃水浴20 min，加入0.3%過氧化氫15 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，用1%山羊血清于室溫下封閉60 min，將一抗兔抗人SERPINA 3多克隆抗體(1∶1000稀釋)加入，4℃過夜孵育，加入二抗，37℃孵育60 min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，以PBS代替一抗作為對照。結(jié)果判定：SERPINA 3主要表達于細胞質(zhì)，以胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色染色為陽性。隨機取5個高倍視野，以染色強度和陽性細胞比例綜合評價[7]，①染色強度：0分，無染色；1分，淡黃色；2分，黃色；3分，棕黃色；②陽性細胞比例：0分，<5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，≥75%；③根據(jù)染色強度和陽性細胞比例得分之和進行判定：0～分，陰性(-)，2～7分，陽性(+)。所有切片均由2位病理科具有主任醫(yī)師職稱的醫(yī)師單獨雙盲完成，并取得一致結(jié)果。

1.3.2 實時熒光定量PCR技術(shù)檢測TSCC和對照組組織中SERPINA 3基因表達 取TSCC或?qū)φ战M組織，研磨后加入細胞裂解液，提取細胞中總RNA，并用紫外分光光度計檢測純度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，用PCR試劑盒對目的基因進行擴增。SERPINA 3基因序列：上游為5′-AAGAGGTAGAGGATAGGG-3′，下游為5′-ATACTATAAACACTCTCCTCT-3′；GAPDH基因：上游為5′-AAGATCATCAGCAATGCCTCC-3′，下游為5′-TGGACTGTGGTCATGAGTCCTT-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，92℃ 30 s，92℃ 30 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s，連續(xù)進行38次循環(huán)，每個樣品設(shè)3個平行反應(yīng)復孔。用2-△△Ct法計算TSCC和對照組組織中SERPINA 3 mRNA相對表達量。

1.3.3 病例隨訪 對所有患者治療后進行隨訪，隨訪形式包括電話、門診，隨訪中失訪3例，隨訪截止至2017年4月30日。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料采用率值表示，組間比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，利用Cox比例風險回歸模型分析TSCC患者生存的影響因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組SERPINA 3的蛋白表達 TSCC組織中SERPINA 3蛋白陽性表達率為71.43%(45/63)，對照組則為33.33%(15/45)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.429，P=0.000)，見圖1。

A.SERPINA 3蛋白在TSCC組織中呈高表達；B.SERPINA 3蛋白在對照組組織中呈低表達，SP×200。

圖1 兩組SERPINA 3蛋白表達

2.2 兩組SERPINA 3的基因表達 TSCC組織中SERPINA 3 mRNA相對表達量為2.08±0.12，對照組則為1.16±0.08，差異有統(tǒng)計學意義(t=44.711，P=0.000)。

2.3 TSCC組織中SERPINA 3蛋白和基因表達與臨床病理特征之間的關(guān)系 TSCC組織中SERPINA 3蛋白和基因表達均與性別和年齡無關(guān)(P>0.05)，而與分化程度、TNM分期和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 TSCC組織中SERPINA 3蛋白和基因表達與臨床病理特征之間的關(guān)系

2.4 TSCC組織中SERPINA 3蛋白表達對預后的影響 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，SERPINA 3蛋白陽性表達組患者5年總體生存率為34.88%，中位生存時間36.30個月，陰性表達組則分別為64.71%和51.24個月，Log-Rank檢驗差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.830，P=0.028)，見圖2。

2.5 TSCC患者預后影響因素分析 Cox比例風險回歸模型分析結(jié)果顯示，SERPINA 3蛋白陽性表達、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是TSCC患者預后的獨立影響因素，見表2。

圖2 TSCC組織中SERPINA 3蛋白表達對預后的影響

表2 TSCC患者預后影響因素的Cox比例風險回歸模型

3 討論

TSCC作為一種侵襲力強、生長迅速、惡性程度高的惡性腫瘤，可導致舌肌運動受限，對患者言語、吞咽、進食等功能造成影響[8]，而且該腫瘤早期轉(zhuǎn)移率較高[9]，多數(shù)患者預后不良。目前，TSCC發(fā)病機制尚未完全清楚，因此，深入探討影響該腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的機制對改善患者預后具有重要意義。SERPINA 3基因位于人染色體14q32.1，是一種炎癥反應(yīng)相蛋白，在機體發(fā)生炎癥反應(yīng)時表達增加具有抗炎功能[10]，但一旦出現(xiàn)SERPINA 3基因大量異常表達時，可抑制細胞凋亡、減少細胞間黏附，而參與了惡性腫瘤發(fā)生及進展過程[11]。已有研究表明，其在子宮內(nèi)膜癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、肝癌[14]等多種惡性腫瘤組織中表達上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，TSCC組織中SERPINA 3蛋白陽性表達率和基因表達量均高于對照組，說明SERPINA 3在TSCC組織中呈高表達，可能參與了TSCC發(fā)病過程。

本研究結(jié)果顯示，TSCC組織中SERPINA 3蛋白和基因表達均與分化程度、TNM分期和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，中低分化、Ⅲ～Ⅳ期和發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中表達量增加，表明SERPINA 3可能參與了TSCC進展過程，與腫瘤惡性進展及轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。有研究指出[15]，SERPINA 3高表達與黑色素瘤患者高病死率有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SERPINA 3蛋白陽性表達組患者5年總體生存率和平均生存時間均低于陰性表達組，說明SERPINA 3蛋白高表達影響患者預后，Cox比例風險回歸模型分析結(jié)果進一步顯示，SERPINA 3蛋白陽性表達是TSCC患者預后的獨立影響因素，因此，SERPINA 3蛋白陽性表達可能是患者預后不良的標志。

綜上所述，TSCC組織中SERPINA 3蛋白和基因呈高表達，且與分化程度、TNM分期和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是影響患者預后的因素之一，有望成為預測患者預后的生物學標志物。