鄧 超，薛進(jìn)朗，郭家奕，王金孟，汪 偉，施六霞，陳傳俊

(皖南醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

牙齦炎(gingivitis)是發(fā)生于牙齦組織的炎癥，表現(xiàn)為牙齦色、形、質(zhì)的改變，探診易出血，隨著病程的發(fā)展其炎性細(xì)胞中相關(guān)分子的免疫功能發(fā)生變化，牙周袋形成、牙槽骨喪失，造成病理性改變從而導(dǎo)致牙周炎(periodontitis)的發(fā)生[1]。有研究表明，人巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒和EB病毒在牙周炎發(fā)病中起著重要的作用[2-3]，其通過促炎細(xì)胞或非炎細(xì)胞釋放損害牙周免疫防御的細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致更具毒性的牙周細(xì)菌的建立[4]。還有學(xué)者認(rèn)為牙周炎的發(fā)展取決于皰疹病毒、特異性致病菌及破壞性炎癥介質(zhì)之間的協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)擬通過研究Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞炎癥因子的分泌情況，探討HSV-1與牙齦炎癥之間的相關(guān)性，以及是否通過影響牙齦成纖維細(xì)胞的生物性能，增加了炎癥因子的分泌，從而加劇了牙齦、牙周疾病的發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、實(shí)驗(yàn)器材及取材 PBS(gibco，USA)；DMEM培養(yǎng)基(HyCIone，USA)；胎牛血清(四季青，杭州)；雙抗(gibco公司,USA)；Human IL-6 ELISA Kit(ABclonal，武漢)；Ⅰ型膠原酶(Solarbio,USA)；胰蛋白酶(gibco，USA)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countstar，上海)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo,USA)；超凈培養(yǎng)臺(tái)(蘇州設(shè)備凈化有限公司,蘇州)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,Japan)。

牙齦組織取材于弋磯山醫(yī)院口腔頜面外科門診因正畸需要拔牙的患者。取材前征得患者及家屬同意。要求患者無(wú)全身性疾病，牙齦組織健康?；颊吣挲g14～20歲。HSV-1病毒由安徽醫(yī)科大學(xué)友情提供，病毒滴度為3×105PFU/mL。

1.2 原代培養(yǎng) 酶消化法培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞：將新鮮取出帶有牙齦組織的牙齒投放在預(yù)冷的含有5×的雙抗的PBS液體中(含青霉素 100 U/mL，鏈霉素100 mg/L)，2 h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在超凈工作臺(tái)中用含有1×雙抗的PBS溶液中反復(fù)沖洗干凈后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀輕輕地刮取牙頸部的牙齦組織塊。1000 r/min離心5 min。棄上清后，加入含3 mg/mL Ⅰ型膠原酶1 mL，37.5℃每隔5 min振蕩，消化40 min，加入少量胎牛血清終止消化。離心后棄上清，加入3 mL DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，將其置于二氧化碳培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃恒溫)中孵育，2～3 d換液。

1.3 傳代培養(yǎng) 待細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底70%～80%時(shí)，PBS沖洗1～2遍，加入少量0.25%含EDTA的胰酶置于5% CO2培養(yǎng)箱，37℃恒溫中消化5 min，終止反應(yīng)后離心去上清，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4 HSV-1病毒刺激 篩選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人牙齦成纖維細(xì)胞在六孔板中進(jìn)行鋪板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔的80%～90%，設(shè)置1個(gè)對(duì)照組(正常培養(yǎng)液)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(實(shí)驗(yàn)組1、2、3 HSV-1刺激濃度分別為1×104PFU/mL、1×105PFU/mL、1×106PFU/mL)，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于48、96 h收集一次上清液，上清液放置于-80℃冷凍保存，96 h后提取細(xì)胞RNA留作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定IL-6含量 使用ABclonal公司的ELISA試劑盒(Human IL-6 ELISA Kit)測(cè)定細(xì)胞上清液中IL-6的含量。按照所提供的實(shí)驗(yàn)步驟稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備試劑盒中所提供的酶標(biāo)板，然后在其中分別加入樣本與標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行稀釋、洗滌與抗體孵育等操作，最后通過酶標(biāo)儀進(jìn)行各組OD值檢測(cè)，并通過Curve Expert 1.4 軟件進(jìn)行ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，并計(jì)算出相應(yīng)的IL-6的含量。

1.6 real-time PCR檢測(cè)各組IL-6 mRNA的含量 培養(yǎng)96 h后提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，β-actin 為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì)參照GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成(表1)。real-time PCR 采用20 μL體系，每管3 個(gè)副孔，重復(fù)3次 。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 牙齦成纖維細(xì)胞的原代及傳代 用全消化法培養(yǎng)原代細(xì)胞，2周左右匯集達(dá)到80%，倒置顯微鏡下，大多數(shù)細(xì)胞呈梭形，胞質(zhì)豐滿，核仁清晰可見，呈典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)排列成束狀，并可見接觸抑制現(xiàn)象(圖1)。

2.2 加病毒前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化 分別用1×104PFU/mL、1×105PFU/mL、1×106PFU/mL 3種濃度的 HSV-1病毒刺激牙齦成纖維細(xì)胞，96 h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，與正常對(duì)照組相比(圖2A)：1×104PFU/mL組細(xì)胞形態(tài)正常，呈長(zhǎng)梭形，無(wú)明顯改變(圖2B)；1×105PFU/mL組細(xì)胞出現(xiàn)少量死亡，細(xì)胞間間隙增大(圖2C)；1×106PFU/mL組細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形，胞核不清晰(圖2D)。

圖1 原代細(xì)胞(×4)

A.正常對(duì)照組細(xì)胞;B.1×104PFU/mL濃度下刺激的細(xì)胞;C.1×105PFU/mL濃度下刺激的細(xì)胞;D.1×106PFU/mL濃度下刺激的細(xì)胞。

圖2 不同病毒濃度刺激后的細(xì)胞狀態(tài)(×10)

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IL-6的含量 用Curve E×pert 1.4 軟件進(jìn)行ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，結(jié)果顯示r=0.996，可信度高(圖3)。

圖3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(r=0.996)

用1×104PFU/mL、1×105PFU/mL、1×106PFU/mL 3組不同濃度的HSV-1刺激牙齦成纖維細(xì)胞，分別于48 h、96 h收集上清液，ELISA檢測(cè)上清液中IL-6的含量，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，48 h后3組實(shí)驗(yàn)組中IL-6的含量均上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；96 h后3組實(shí)驗(yàn)組中IL-6的含量也均上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組96 h IL-6分泌量均高于48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度刺激下上清液中IL-6的含量 ng/L

注：多組間兩兩比較，符號(hào)不同表示P<0.05。

2.4 病毒刺激前后牙齦成纖維細(xì)胞IL-6 mRNA的表達(dá) 不同濃度HSV-1刺激牙齦成纖維細(xì)胞96 h后進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，3組實(shí)驗(yàn)組IL-6 mRNA的表達(dá)量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但1×105PFU/mL濃度組和 1×106PFU/mL濃度組IL-6 mRNA的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 96 h后各組細(xì)胞中IL-6 mRNA 的表達(dá)(RQ)

注：多組間兩兩比較，符號(hào)不同表示P<0.05。

3 討論

牙周炎的致病因素很多，細(xì)菌致病學(xué)說中提到牙周炎的發(fā)病機(jī)制主要由牙周致病菌的毒力因子引起，常見的牙周致病菌包括福賽斯類桿菌、牙齦卟啉單胞菌和伴放線放線桿菌，這些細(xì)菌在體外表達(dá)多種毒力因子如 Cag E 蛋白、白細(xì)胞毒素、脂多糖和細(xì)胞致死膨脹毒素等，這些毒力因子加劇了牙周疾病的發(fā)生。但細(xì)菌致病學(xué)說并不能很好地解釋牙周病的部位特異性以及間斷爆發(fā)性等問題，提示除細(xì)菌致病學(xué)說以外，還存在其他的致病因素，有學(xué)者研究表明，在牙周炎患者齦溝液中檢測(cè)到皰疹病毒，并可以通過牙周基礎(chǔ)治療降低皰疹病毒的感染率[5]；在不同嚴(yán)重程度的牙周炎患者中皰疹病毒的含量隨著病變的嚴(yán)重程度而顯著增加，皰疹病毒可能在增加疾病的嚴(yán)重程度方面發(fā)揮作用[6]。

白細(xì)胞介素-6(IL-6)是牙周炎中最有效的促炎細(xì)胞因子之一，與牙周炎的發(fā)展息息相關(guān)。有學(xué)者用IL-1β和IL-6 共刺激人牙齦成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其顯著誘導(dǎo)細(xì)胞中STAT3，ERK和JNK的磷酸化，并增強(qiáng)了各種炎癥相關(guān)分子如MMP-1，MCP-1，IL-1ra，bFGF和VEGF的表達(dá)[7]。牙周炎患者的牙齦組織、牙周組織中可檢測(cè)出大量的IL-6，其IL-6表達(dá)水平的增加可能與IL-6啟動(dòng)子甲基化相關(guān)[8-9],大量的炎性介質(zhì)改變了牙齦細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞的生物學(xué)性能，加劇了牙周炎癥的發(fā)展。

在本研究中，選用單純皰疹病毒(HSV-1)感染實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，通過將實(shí)驗(yàn)前后記錄的圖片進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)牙齦成纖維細(xì)胞隨病毒濃度的增高以及感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)目急劇減少，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形，出現(xiàn)大量的死亡，而對(duì)照組細(xì)胞則無(wú)以上所述變化，正常生長(zhǎng)。此外，經(jīng)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HSV-1感染的實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)了炎癥因子(IL-6)的表達(dá)，并隨著病毒濃度的增大，時(shí)間的延長(zhǎng)，炎癥因子分泌量增多，IL-6 mRNA的表達(dá)量在3種濃度的實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)均上調(diào)，但在 1×105PFU/mL濃度組和 1×106PFU/mL濃度組并無(wú)明顯差異，并未隨著單純皰疹病毒刺激濃度的增加而上升，這可能與高濃度病毒導(dǎo)致細(xì)胞死亡有關(guān)，過多的炎癥因子分泌到上清液中，故ELISA檢測(cè)上清液中IL-6含量上升，但存活細(xì)胞中IL-6的mRNA表達(dá)量并未增加。

本研究雖然不能證明HSV-1與牙周炎的發(fā)生直接相關(guān)，但可以確定HSV-1病毒影響了人牙齦成纖維細(xì)胞的功能，并導(dǎo)致細(xì)胞炎性分泌的改變。皰疹病毒能夠在牙齦組織中繁殖，也可能介導(dǎo)對(duì)宿主免疫應(yīng)答的損害，在牙周病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。因此，在今后預(yù)防和治療牙周炎的同時(shí)可能需要同時(shí)考慮控制皰疹病毒的影響，以期獲得更好的治療效果。