竺 紅，羅云霞，周 艷，楊亞珊

(1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院 風濕科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004)

原發(fā)性干燥綜合征(primary Sjogren′s syndrome，pSS)是一種以侵犯外分泌腺為主的彌漫性結締組織病，其特異性抗體有抗核抗體(anti-nuclear antibody，ANA)、抗SSA抗體及抗SSB抗體，pSS患者中抗SSA/Ro抗體和抗SSB/La抗體的陽性率分別為75%和40%[1]，靈敏度較低。pSS的發(fā)病機制尚未明確，大多數(shù)學者認為感染、遺傳、內分泌等多因素共同參與了本病的發(fā)生和進展；同時，易感人群感染某些病毒后通過分子模擬機制也可誘發(fā)該自身免疫反應。目前，有學者通過引入全基因組關聯(lián)分析研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)pSS具有多個易感基因[2]，因此，pSS的發(fā)病可能與遺傳因素密切相關。近年來，環(huán)狀RNA(circRNA)已成為RNA領域研究的最新熱點，它是一類通過特殊剪切機制形成的并能在真核細胞中廣泛表達的具有閉合環(huán)狀結構的非編碼RNA。研究表明，circRNA通過與疾病關聯(lián)的微小RNA(miRNA)相互作用，在腫瘤、炎癥、神經(jīng)退行性等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調控作用[3-4]。目前，有關circRNA 參與調控pSS進程的研究報道較少，本文旨在探討pSS的circRNA譜是否存在差異表達，為進一步探討circRNA在pSS發(fā)病機制中的作用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準：病例組為寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院風濕科2017年住院患者，均符合2002年pSS國際分類(診斷)標準，其中女性3例，男性1例，年齡27～52歲。對照組為本院同期健康體檢者，均為女性，年齡22～29歲。排除標準：合并其他自身免疫性疾病、感染及器質性病變的患者。以上病例均獲得患者的知情同意及寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會的批準(2017-053)。

1.2 血樣的采集和處理 EDTA抗凝管采集受試者靜脈全血10 mL混勻，采用百泰克裂解buffer(TRIpure LS Reagent)裂解處理，充分混勻后存放于-80℃冰箱中保存。

1.3 circRNA芯片篩查 首先對受試者的全血進行RNA提取，并對提取的RNA進行質控管理，按照試劑盒操作說明，對每份受試樣本的總RNA采用隨機引物擴增，反轉錄為熒光標記的cRNA，然后在circRNA芯片上進行雜交、洗片、掃描。采用Feature Extraction提數(shù)軟件預處理分析，然后采用GeneSpring GX軟件計算基因表達的差異性及統(tǒng)計學差異性。差異倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)≥2.0為表達具有差異性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.4 生物學分析 通過miRanda軟件預測miRNA可能結合的circRNA，對差異的circRNA對應的線性mRNA轉錄本進行基因本體論(GO)和通路(Pathway)分析。采用miRNAWalk 2.0在線預測miRNA靶基因(網(wǎng)址：http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/mir-mir-self.html)。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩組間差異性比較用兩獨立樣本t檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病例組與對照組circRNA表達譜比較 病例組與對照組共檢測到157 778個circRNA靶點。通過比較發(fā)現(xiàn)437個circRNAs表達具有差異性(FC≥2.0，P<0.05)，其中上調circRNA 365個，下調circRNA 72個。表1、2分別總結了其FC值排序前10個上調和下調的circRNA、FC值、P值、所在染色體、circRNA所在鏈、涉及的基因、結合miRNA數(shù)量。

表1 通過倍數(shù)變化(FC)選擇前十位pSS患者外周血中上調的circRNA的表達改變

表2 通過倍數(shù)變化(FC)選擇前十位pSS患者外周血中下調的circRNA的表達改變

2.2 染色體中circRNA的異常表達 將具有差異性表達的circRNA進行分類。結果表明：這些circRNAs廣泛分布于所有染色體，其中包括性染色體。pSS患者中上調的circRNAs約10.14%來自染色體1(chr 1)、7.95%來自chr 2，而來自其他染色體的上調circRNA的百分比均<7%(圖1)。表達下調的circRNA的前3個染色體分別為chr 2(22.2%)、chr 1(15.28%)、chr 12(13.89%)(圖2)。

圖1 表達上調的circRNAs染色體分布

圖2 表達下調的circRNAs染色體分布

2.3 circRNA(hsa-circRNA12807-10)的作用靶miRNA(hsa-miR-181a-5p)-mRNA/基因相互作用網(wǎng)絡預測 依據(jù)circRNA與其作用靶miRNA結合的緊密程度及種子序列配對堿基的多少，將每個circRNA預測出靶miRNA。其中表達下調的前十位circRNA有1個circRNA(hsa-circRNA12807-10)的預測結果中有1個miRNA(hsa-miR-181a-5p)與有關文獻中報道的結果一致。

3 討論

circRNA是RNA在剪切過程中產(chǎn)生的主要由外顯子和(或)內含子組成的閉合環(huán)狀RNA分子，廣泛存在于真核細胞中，其在真核轉錄組中具有相對無阻礙的框架[5]，具有很強的穩(wěn)定性、物種保護及細胞和組織的特異性[6]。circRNA可在轉錄或轉錄后通過結合miRNA或其他分子[7-8]調控基因的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)：circRNA能夠競爭性結合miRNA，降低miRNA對其作用靶的抑制，即miRNA的海綿作用，進而調控miRNA的功能[9]。因此，circRNA可能成為新的生物標志物和治療靶點[10]。

近年來對circRNA的研究已成為熱點，但對于circRNA在pSS發(fā)病機制中的作用研究尚少。本研究中，我們利用circRNA微陣列獲得病例組及對照組的circRNA表達譜，其中病例組外周血中具有統(tǒng)計學差異，上調和下調circRNAs分別有365個和72個，產(chǎn)生這些差異性表達的circRNA的基因廣泛分布于包括性染色體在內的所有染色體中。同時，病例組中下調的circRNA主要從chr 2(22.2%)、chr 1(15.28%)及chr 12(13.89%)轉錄，而上調的circRNA在染色體中的分布相對比較均勻。因此，染色體中circRNA的分布狀態(tài)可能與其參與的生物過程有關，因為circRNA的序列在很大程度上決定了它所結合目標，所以circRNA可能與pSS的發(fā)病機制有關。

circRNA-miRNA-mRNA調控軸中的海綿miRNA如ciRS-7、CDR1as是circRNA的公認功能之一。目前，大量研究已經(jīng)證實miRNAs參與生物體的生長、發(fā)育、衰老、凋亡的調控及遺傳背景的穩(wěn)定[11-12]，并廣泛應用于多種疾病領域研究。本研究對circRNA產(chǎn)生的相關基因進一步做了生物信息學分析。使用miRanda軟件預測miRNA可能結合的circRNA，對具有統(tǒng)計學差異性的circRNA相關線性miRNA轉錄體進行GO和Pathway分析。GO生物學過程提示：這些基因主要參與生物調節(jié)過程、細胞組分、代謝及酶活性調節(jié)等；KEGG Pathway分析提示：circRNA主要參與氨基酸的降解及合成。值得注意的是預測過程中發(fā)現(xiàn)：circRNA中有一個靶miRNA(hsa-miR-181a-5p)曾在文獻中有過報道[13]，即其在pSS患者血清中呈現(xiàn)上調，且與ANA的滴度表現(xiàn)為正相關。miR-181a參與T、B細胞發(fā)育及T細胞的活化、分化[14]，然而在研究過程中發(fā)現(xiàn)其預測的上游調節(jié)子hsa-circRNA12807-10卻在pSS中下調，這意味著它可能會使miRNA-181a-5p海綿化，影響T、B細胞的生物學過程。因此我們對circRNA(hsa-circRNA12807-10)在circRNA(hsa-circRNA12807-10)-miRNA(hsa-miR-181a-5p)-mRNA/基因相互作用網(wǎng)絡中的地位進行了預測。推測它可能通過影響靶miRNA的活性或者競爭結合靶miRNA來調節(jié)miRNA與靶mRNA或者靶基因的作用。

本研究主要通過分析pSS中circRNA表達譜的差異性，為闡明pSS的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找新的臨床診斷標志物提供新思路。但仍需進一步的實驗驗證，具體可通過觀察circRNA吸附特定miRNA進而對mRNA表達的影響，結合circRNA與mRNA表達譜聯(lián)合分析，探討circRNA、miRNA、mRNA三者之間的關系及miRNA海綿作用機制，進而明確pSS中circRNA的功能。