王勤志，高 琨，徐立軍，李名武，周 聰，王亞柱

(1. 鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，湖北 黃石 435000；2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，遼寧 沈陽 110000)

由于神經(jīng)損傷后具有不可逆性[1]，故急性脊髓損傷(acute spinal cord injury，ASCI)具有較高的致殘、致死率。研究表明[2]，對(duì)于脊髓未完全損傷的ASCI患者，早期采取合理的診治措施可在一定程度上促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)，改善患者預(yù)后。有研究指出[3]，免疫炎癥反應(yīng)在ASCI病程進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。微小RNA(micro RNA，miRNA)作為廣泛存在于機(jī)體內(nèi)高度保守的短鏈非編碼RNA，在組織發(fā)育、器官形成、代謝等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[4]，miR-146a和miR-155作為miRNA重要類型，參與調(diào)控了免疫和炎癥反應(yīng)過程[5]。本研究擬對(duì)ASCI患者外周血中miR-146a和miR-155變化進(jìn)行分析，探討其在ASCI患者早期病情評(píng)估中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月～2016年12月在黃石市中心醫(yī)院就診的ASCI患者65例，男性42例，女性23例，平均年齡(50.2±8.6)歲，致傷原因：墜落傷8例，交通事故43例，摔傷12例，重物砸傷2例。損傷部位：頸椎損傷54例，胸腰椎損傷11例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲，有明確的外傷史，經(jīng)影像學(xué)檢查明確；②入院時(shí)距離創(chuàng)傷發(fā)生時(shí)間在8 h內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重顱腦損傷者；②心肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；③既往有脊髓或顱腦損傷史者；④急慢性感染、惡性腫瘤、腦血管疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病者；⑤近半年內(nèi)接受過脊髓或顱腦手術(shù)者。根據(jù)美國(guó)脊髓損傷協(xié)會(huì)制定的分類標(biāo)準(zhǔn)(ASIA標(biāo)準(zhǔn))分組：完全損傷組(A級(jí))和不完全損傷組(B、C、D級(jí))。完全損傷組22例，男性15例，女性7例，平均年齡(50.8±8.9)歲，損傷部位：頸椎損傷15例，胸腰椎損傷7例；不完全損傷組43例，男性25例，女性18例，平均年齡(49.7±8.4)歲，損傷部位：頸椎損傷28例，胸腰椎損傷15例。同期，選取脊柱創(chuàng)傷但神經(jīng)功能正常者26例作為脊髓正常組(ASIA標(biāo)準(zhǔn)：E級(jí))，男性19例，女性7例，平均年齡(50.4±8.6)歲，損傷部位：頸椎損傷15例，胸腰椎損傷11例。從體檢中心選取健康者40例作為對(duì)照組，排除標(biāo)準(zhǔn)同ASCI患者，其中，男性23例，女性17例，平均年齡(48.9±8.1)歲，入選對(duì)象性別、年齡等一般資料無差異。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入選對(duì)象或其家屬均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 所有ASCI患者于傷后8 h內(nèi)采取大劑量甲潑尼龍沖擊治療，先給予30 mg/kg劑量靜脈泵注45 min；15 min后按5.4 mg/(kg·h)的劑量持續(xù)靜脈滴注23 h。所有ASCI患者M(jìn)RI檢查均示有頸或胸腰脊髓壓迫，于48 h內(nèi)進(jìn)行前路減壓植骨內(nèi)固定手術(shù)治療。所有患者術(shù)后隨訪6個(gè)月以上，隨訪過程中未出現(xiàn)失訪病例，并于6個(gè)月隨訪時(shí)對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.2 標(biāo)本采集和處理 所有患者分別于傷后12、24、36、48和72 h時(shí)，對(duì)照組于體檢當(dāng)日，抽取肘靜脈血5 mL，3000 r/min離心10 min，留取血漿，保存于-80℃冰箱以備檢。

1.2.3 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)外周血中miR-146a和miR-155表達(dá) 取血漿，解凍，加入細(xì)胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒(購自美國(guó)Promega公司)提取總RNA，并檢測(cè)純度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自日本Toyobo公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。用PCR試劑盒(購自日本Toyobo公司)以cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，56℃ 60 s，74℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行40次循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。利用2-△△Ct法計(jì)算血漿中miR-146a和miR-155相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 ASCI患者治療后神經(jīng)功能恢復(fù)情況 術(shù)后6個(gè)月時(shí)，完全損傷組(A級(jí))22例患者中，有3例(13.6%)神經(jīng)功能改善，16例(72.7%)神經(jīng)功能無明顯改善，3例(13.6%)分別于創(chuàng)傷后10、11和15 d時(shí)死亡；不完全損傷組(B、C、D級(jí))43例患者，30例(69.8%)神經(jīng)功能改善，13例(30.2%)神經(jīng)功能無改善。

2.2 ASCI患者、脊髓正常組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)外周血中miR-146a表達(dá) 與傷后12 h相比，完全損傷組、不完全損傷組和脊髓正常組患者傷后24、36、48和72 h時(shí)外周血中miR-146a相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低，傷后24 h時(shí)達(dá)最大值(P<0.05)；四組患者傷后12、24、36、48和72 h時(shí)外周血中miR-146a表達(dá)量比較：完全損傷組>不完全損傷組>脊髓正常組>對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、3。

表2 ASCI患者不同時(shí)點(diǎn)外周血中miR-146a表達(dá)

注：對(duì)照組外周血miR-146a水平為1.06±0.10，與傷后12 h相比，aP<0.05；與對(duì)照組相比，bP<0.05；與脊髓正常組相比，cP<0.05；與不完全損傷組相比，dP<0.05。

表3 ASCI患者和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)外周血中miR-146a表達(dá)重復(fù)測(cè)量方差分析

注：Mauchly球形檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量W=0.777，P=0.000。

2.3 ASCI患者、脊髓正常組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)外周血中miR-155表達(dá) 與傷后12 h相比，完全損傷組、不完全損傷組和脊髓正常組患者傷后24、36、48和72 h時(shí)外周血中miR-155相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低，傷后24 h時(shí)達(dá)最大值(P<0.05)；3組患者傷后12、24、36、48和72 h時(shí)及對(duì)照組外周血中miR-155表達(dá)量比較：完全損傷組>不完全損傷組>脊髓正常組>對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4、5。

表4 ASCI患者不同時(shí)點(diǎn)外周血中miR-155表達(dá)

注：對(duì)照組外周血miR-146a水平為1.06±0.10，與傷后12 h相比，aP<0.05；與對(duì)照組相比，bP<0.05；與脊髓正常組相比，cP<0.05；與不完全損傷組相比，dP<0.05。

表5 ASCI患者和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)外周血中miR-155表達(dá)重復(fù)測(cè)量方差分析

注：Mauchly球形檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量W=0.887，P=0.089。

2.4 ASCI患者傷后24 h時(shí)外周血中miR-146a和miR-155表達(dá)量在鑒別完全性損傷中的價(jià)值 ROC曲線分析顯示，ASCI患者傷后24 h時(shí)外周血中miR-146a和miR-155相對(duì)表達(dá)量在預(yù)測(cè)完全性損害時(shí)，曲線下面積分別為0.904(95%CI：0.830～0.978)和0.808(95%CI：0.695～0.920)，當(dāng)分別取2.31和2.52時(shí)，靈敏度為72.7%(16/22)和59.1%(13/22)，特異度為93.0%(40/43)和90.7%(39/43)；兩者聯(lián)合時(shí)，曲線下面積0.976(95%CI：0.945～1.000)，靈敏度93.0%(20/22)，特異度95.5%(41/43)，見圖1。

圖1 ASCI患者傷后24 h時(shí)外周血中miR-146a和miR-155表達(dá)量在鑒別完全性損害中的價(jià)值

3 討論

ASCI作為脊髓外科常見的危重癥，包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，對(duì)于原發(fā)性損傷，治療的關(guān)鍵在于盡量控制風(fēng)險(xiǎn)，減少繼發(fā)性損傷并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[6]，科學(xué)評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度對(duì)指導(dǎo)治療尤為重要，但也是脊柱外科研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，臨床上判定ASCI嚴(yán)重程度主要依靠臨床表現(xiàn)及影像學(xué)檢查，但該方法對(duì)設(shè)備及檢查條件要求較高，且無法實(shí)時(shí)觀察患者病情變化，同時(shí)，由于脊髓休克期時(shí)間長(zhǎng)短不一，限制了對(duì)神經(jīng)功能的評(píng)定[7]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[8]，大鼠急性脊髓損傷后miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化。miR-146a和miR-155作為miRNA重要類型，在免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可通過抑制相應(yīng)的靶分子表達(dá)而增加炎癥因子生成[9]，本研究嘗試對(duì)ASCI患者外周血中miR-146a和miR-155表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，與傷后12 h相比，完全損傷組、不完全損傷組和脊髓正常組患者傷后24、36、48和72 h時(shí)外周血中miR-146a和miR-155相對(duì)表達(dá)量均呈先升高后降低，傷后24 h時(shí)達(dá)最大值，分析原因，ASCI患者早期繼發(fā)了炎癥反應(yīng)，而隨著治療措施的干預(yù)，在一定程度上抑制了炎癥反應(yīng)，從而減輕了炎癥反應(yīng)，所以出現(xiàn)了miR-146a和miR-155表達(dá)量降低。本研究結(jié)果顯示，不同時(shí)點(diǎn)患者外周血中miR-146a和miR-155相對(duì)表達(dá)量均為：完全損傷組>不完全損傷組>脊髓正常組>對(duì)照組，說明miR-146a和miR-155表達(dá)與脊髓損傷及損傷嚴(yán)重程度有關(guān)，同時(shí)，脊髓正常組患者外周血中miR-146a和miR-155相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，亦提示脊柱創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致外周血中miR-146a和miR-155表達(dá)量升高，但升高幅度要低于ASCI患者。ROC結(jié)果顯示，ASCI患者傷后24 h時(shí)外周血中miR-146a和miR-155相對(duì)表達(dá)量聯(lián)合在預(yù)測(cè)完全性損害時(shí)，具有較好的靈敏度和特異度，提示ASCI患者傷后24 h時(shí)miR-146a和miR-155表達(dá)量可作為評(píng)估ASCI患者病情嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)。

綜上所述，ASCI患者外周血中miR-146a和miR-155表達(dá)量升高，且隨時(shí)間而變化，可作為評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)，對(duì)指導(dǎo)患者手術(shù)時(shí)機(jī)選擇具有一定參考價(jià)值，但鑒于本研究樣本量有限，尚需進(jìn)一步開展大規(guī)模的臨床研究以確證。