孫恩濤，楊邦和，陶香林，葉長江，李朝品

(皖南醫(yī)學院 檢驗學院，安徽 蕪湖 241002)

伯氏嗜木螨(Caloglyphusberlesei)屬無氣門亞目(Astigmata)、粉螨科(Acaridae)。該螨性喜高溫潮濕，常孳生于潮濕發(fā)霉的儲藏物，也可侵害中華真地鱉、美洲大蠊等資源昆蟲的卵和幼蟲，造成相當大的經濟損失。在適宜的溫、濕度條件下，伯氏嗜木螨大量孳生，可對人們的生活環(huán)境造成污染，引起哮喘等變態(tài)反應性疾病，甚至可通過某種途徑進入人體，導致人體內螨病[1]。本研究測定并分析了伯氏嗜木螨的線粒體基因組全序列。

1 材料與方法

1.1 樣品采集、飼養(yǎng)和鑒定 伯氏嗜木螨采自中華真地鱉培養(yǎng)床上的培養(yǎng)料，挑取單個雌螨在實驗室(25±1)℃、85%RH、無光照的條件下進行“克隆”培養(yǎng)。經過7～8周的培養(yǎng)后，在解剖鏡下直接分離出成螨，一部分制作成玻片標本以作形態(tài)鑒定[1]，一部分饑餓24 h后用70% 酒精固定保存，存放于-80℃超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用傳統的酚氯仿提取基因組DNA。同時，利用DNeasy Tissue Kit(Qiagen，Hilden，Germany)試劑盒進行10個單個雌螨基因組DNA的提取。

1.2.2 引物設計、長片段PCR擴增及測序 用節(jié)肢動物線粒體基因的通用引物[2-4]，擴增出線粒體cox1、cob、rrnS和nad4-nad5基因序列，設計上述4個基因片段區(qū)間的長片段擴增引物(表1)，反應總體積為50 μL，含LA-PCR BufferⅡ (Mg2+plus) 5 μL，dNTPs 8 μL，引物各1 μL，模板DNA濃度約為100 ng，LA Taq酶0.5 μL (5 U/μL)，加無菌水補足。反應條件為：94℃預變性60 s；98℃變性10 s，退火與延伸在同一溫度下進行，55～60℃ 5 min，34個循環(huán)，72℃終延伸10 min。通過Long-PCR擴增出大片段后，對純化后的PCR產物進行步移法測序。

1.2.3 數據處理及分析 用DNAStar 軟件包的Editseq和Seqman軟件進行序列拼接和組裝，得到線粒體基因組全序列。采用Clustal X 2.0軟件，參考已測定的橢圓食粉螨線粒體基因組全序列(序列號KC700022)[5]，查找蛋白質編碼基因、rRNA和tRNA在線粒體基因組全序列中的位置；用tRNAscan-SE1.23和ARWEN構建tRNA的二級結構進行鑒定[6-7]。假定控制區(qū)的二級結構用Mfold Server在線軟件構建[8]。

表1 伯氏嗜木螨線粒體基因組擴增所用的PCR引物

2 結果

2.1 線粒體基因組結構和基因排布 伯氏嗜木螨mtDNA為閉合環(huán)狀分子，其長度為14 273bp(序列號KF499016)，由13個蛋白質編碼基因，22個tRNA和2個rRNA基因構成，見表2。

2.2 tRNA基因 伯氏嗜木螨tRNA基因長度為47～63 bp，平均長度為(53.6±3.49)bp。在所預測的二級結構中，僅trnK能形成三葉草結構，trnD等15個基因呈TV-loop結構，trnR等6個基因缺少D-臂，缺失可變臂和配對的莖。

2.3 非編碼區(qū) 伯氏嗜木螨mtDNA最大的非編碼區(qū)(LNR)長341 bp，位于trnF和trnS1之間，AT含量為89.4%，高于其他區(qū)域。二級結構分析顯示，LNR存在類似微衛(wèi)星的“(AT)n”序列，且存在個體異質性(44～50 bp)。在AT重復序列的下游，是1個富含AT的區(qū)域，其AT含量可達94.29%，形成1個莖環(huán)結構。緊接AT富集區(qū)下游，形成1個含有短的回文序列(5′-ATGTA和TACAT-3′)的莖環(huán)結構。同時，在靠近LNR的3′端，還發(fā)現了一個穩(wěn)定的莖環(huán)結構，即由一個的連接環(huán)(GTTAAAAA)將28 bp的莖和發(fā)夾結構連接起來。此外，還預測有3個能穩(wěn)定形成莖環(huán)的二級結構。

表2 伯氏嗜木螨線粒體基因組的結構

inta:間隔區(qū)，負值為相鄰基因重疊；LNR:最大的非編碼區(qū)；在次要鏈上編碼的基因用下劃線表示。

3 討論

隨著分子生物學技術的發(fā)展，越來越多的蜱螨線粒體基因組提交到數據庫中，并廣泛地應用于蜱螨各個階元的系統學研究中。本研究獲得了伯氏嗜木螨線粒體基因組全序列，長度為14 273 bp，所編碼的37個基因，其相對位置與已釋放的無氣門亞目中橢圓食粉螨、屋塵螨和粉塵螨相一致[9]。

伯氏嗜木螨線粒體tRNA基因具有缺乏T-臂或D-臂的非典型結構，這與真螨總目螨類線粒體tRNA基因的長度顯著縮短一致，其是否具有正常的功能，尚需進一步的線粒體轉錄組學研究。

節(jié)肢動物線粒體控制區(qū)一般有較高的AT含量，作為復制起點的識別信號poly-T/A和形成潛在的莖環(huán)結構等[10]。伯氏嗜木螨LNR的AT含量高，且形成多個潛在的莖環(huán)結構。因此，我們推測伯氏嗜木螨線粒體LNR為其線粒體基因組的控制區(qū)。本研究測序獲得伯氏嗜木螨線粒體基因組全序列，為推動蜱螨分子系統學的研究提供了基礎信息。