黃 銳，倪進(jìn)忠，賈元威，丁 見，龔 鑫

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002；2. 皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 臨床藥學(xué)部，安徽 蕪湖 241001)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是與年齡密切相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，隨著世界人口老年化速度的加快，AD已經(jīng)嚴(yán)重威脅老年人的健康與生活質(zhì)量。AD的治療目前尚無(wú)特效手段，而有報(bào)道表明電針對(duì)改善AD患者的認(rèn)知功能具有明顯效果[1]。天麻素是從中藥天麻的塊莖中提取的主要成分，有報(bào)道[2]天麻素可減輕Aβ蛋白對(duì)AD小鼠腦神經(jīng)元的損害作用從而改善其學(xué)習(xí)記憶能力。沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在AD的治療中密切相關(guān)，有報(bào)道[3]表明BDNF可通過(guò)上調(diào)SIRT1的表達(dá)抑制Aβ蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。關(guān)于電針結(jié)合天麻素對(duì)AD大鼠額葉皮質(zhì)BDNF與SIRT1的表達(dá)情況尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電針與天麻素聯(lián)合治療，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法觀察各組大鼠額葉皮質(zhì)BDNF與SIRT1的表達(dá)情況，旨在探討針?biāo)幗Y(jié)合治療AD的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康SD 雄性大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為6組：正常組，假手術(shù)組，模型組，電針組，天麻素組和針?biāo)幗Y(jié)合組，每組10只。

1.2 主要試劑 D-半乳糖、Aβ1-40購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，天麻素注射液(規(guī)格5 mL∶500 mg，購(gòu)自西南藥業(yè)股份有限公司，兔抗BDNF與SIRT1及SABC試劑盒均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型制備 模型組、電針組、天麻素組與針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠均腹腔注射D-半乳糖120 mg/(kg·d)，1次/天，連續(xù)8周。將Aβ1-40 按說(shuō)明書溶于生理鹽水并置于恒溫箱中孵育1周。以上各組大鼠注射結(jié)束后，以10%水合氯醛按3 mL/kg麻醉，參照包新民等著作的《大鼠腦立體定位圖譜》取前囟后3.5 mm，兩側(cè)2.0 mm，深度為2.8 mm，微量注射器注射Aβ1-40(5 g/L)2μL，碘伏消毒，縫合皮膚，術(shù)后進(jìn)行抗感染治療3 d。正常組大鼠不做處理，假手術(shù)組參照模型組分別以同等劑量的生理鹽水進(jìn)行腹腔注射和雙側(cè)海馬定位注射。

1.4 治療方法 正常組、假手術(shù)組、模型組均不做治療。電針組參照《大鼠穴位圖譜的研制》，取 “百會(huì)”、 “大椎” 和雙側(cè)“足三里”穴，頻率2 Hz，每次30 min，連續(xù)4周。天麻素組按10 mg/kg劑量腹腔注射天麻素注射液，1次/天，連續(xù)4周。針?biāo)幗Y(jié)合組穴位電針方法同電針組，腹腔注射天麻素注射液方法同天麻素組，連續(xù)4周。

1.5 組織標(biāo)本制備 各組大鼠均以10%水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行腹腔麻醉，剪開胸腔，暴露心臟。沿左心室-升主動(dòng)脈快速滴注預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液，取腦，置于4℃多聚甲醛溶液中24 h，依次經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

1.6 免疫組化檢測(cè) 取各組大鼠額葉皮質(zhì)進(jìn)行冠狀切片，片厚5 μm。按免疫組化試劑盒說(shuō)明書依次各步驟，封片，鏡下觀察。每組取額葉皮質(zhì)冠狀切片各20張(每只大鼠隨機(jī)選取2張)，統(tǒng)計(jì)400倍視野下額葉皮質(zhì)BDNF與SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均灰度值(灰度值越大說(shuō)明表達(dá)越弱，反之則越強(qiáng))。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值變量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，各組大鼠額葉皮質(zhì)均可見BDNF與SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞，呈棕黃色，主要為胞質(zhì)和胞膜著色。與正常組比較，假手術(shù)組BDNF與SIRT1表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，模型組BDNF與SIRT1呈弱陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)，著色較淡，平均灰度值增高(P<0.05)；與模型組比較，電針組、天麻素組與針?biāo)幗Y(jié)合組BDNF與SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，著色加深，平均灰度值降低(P<0.05)；與電針組或天麻素組比較，針?biāo)幗Y(jié)合組BDNF與SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，平均灰度值降低(P<0.05)。見圖1、2，表1。

A.正常組;B.假手術(shù)組；C.模型組；D.電針組；E.天麻素組；F.針?biāo)幗Y(jié)合組。標(biāo)尺=30 μm(SABC法，×400 )。

圖1 各組大鼠額葉皮質(zhì)BDNF的表達(dá)

A.正常組;B.假手術(shù)組；C.模型組；D.電針組；E.天麻素組；F.針?biāo)幗Y(jié)合組。標(biāo)尺=30 μm(SABC法，×400 )。

圖2 各組大鼠額葉皮質(zhì)SIRT1的表達(dá)

表1 各組大鼠額葉皮質(zhì)BDNF與SIRT1的表達(dá)

注：與正常組或假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與針?biāo)幗Y(jié)合組比較，▲P<0.05。

3 討論

AD主要病理表現(xiàn)為Aβ蛋白沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)[4]，沉積的Aβ蛋白可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)一步損傷線粒體從而引起細(xì)胞功能障礙[5]。BDNF作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員，可促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)與再生，并可減少氧自由基對(duì)神經(jīng)元的損傷[6]。SIRT1作為氧化應(yīng)激損傷中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在富含線粒體的組織中高表達(dá)，可增強(qiáng)組織細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力[7]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到模型組大鼠額葉皮質(zhì)BDNF與SIRT1的表達(dá)低于正常組或假手術(shù)組，提示可能由于AD大鼠腦組織的抗氧化應(yīng)激能力下降，進(jìn)一步造成對(duì)額葉皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷。有報(bào)道[8]表明SIRT1可減弱Aβ蛋白沉積從而改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。BDNF可通過(guò)上調(diào)SIRT1的表達(dá)而抑制Aβ蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[3]，因此促進(jìn)BDNF與SIRT1的表達(dá)可能是治療AD的潛在策略之一。

電針對(duì)于AD的治療具有安全無(wú)副作用的優(yōu)勢(shì)。王康鋒等[9]電針治療AD患者總有效率達(dá)到83.33%，明顯改善AD患者的認(rèn)知功能。有研究[10]表明電針可減少Aβ蛋白的生成，改善AD動(dòng)物模型的認(rèn)知功能，可能與上調(diào)BDNF表達(dá)有關(guān)。電針可上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)，改善AD大鼠海馬神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)AD大鼠的腦保護(hù)作用[11]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD病理機(jī)制為髓海失養(yǎng)，血瘀痰濁，阻塞腦絡(luò)，“百會(huì)”和“大椎”均為督脈要穴，有醒腦開竅，去瘀血痰濁之功效，“足三里”為足陽(yáng)明胃經(jīng)穴，可補(bǔ)氣血，填精益髓[12]，故本實(shí)驗(yàn)選取上述穴位進(jìn)行電針治療。實(shí)驗(yàn)中觀察到電針組大鼠額葉皮質(zhì)BDNF與SIRT1的表達(dá)均上調(diào)，提示電針可能通過(guò)增強(qiáng)腦組織的抗氧化應(yīng)激能力，促進(jìn)神經(jīng)纖維的良性再生，發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的損傷修復(fù)作用。

天麻素是中藥天麻中含量最高的有效單體成分，具有抗老年癡呆、抗氧化應(yīng)激等多種藥理學(xué)效應(yīng)。天麻素可抑制Aβ蛋白和纖維斑塊的形成，進(jìn)而阻止AD病變的發(fā)展[13]。天麻素可通過(guò)上調(diào)SIRT1的表達(dá)，提高組織細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激損傷能力[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示電針組與天麻素組額葉皮質(zhì)BDNF與SIRT1的表達(dá)強(qiáng)于模型組，尤以針?biāo)幗Y(jié)合組的表達(dá)最為顯著，提示電針與天麻素可能通過(guò)上調(diào)AD大鼠額葉皮質(zhì)BDNF與SIRT1的表達(dá)，增強(qiáng)腦組織抗氧化應(yīng)激能力，從而達(dá)到對(duì)AD大鼠的腦保護(hù)作用。電針結(jié)合天麻素的療效優(yōu)于單用電針或天麻素治療，具有顯著的增效作用，這可能是通過(guò)提高靶細(xì)胞對(duì)藥物的生物利用度等途徑而產(chǎn)生[15]，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。