張雨微，黃 銳，錢閨唐，郭娜君，朱 迪

(皖南醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征是大腦皮層及海馬區(qū)β-淀粉樣肽(Aβ)積累形成老年斑，伴隨緩慢的炎性病理改變[1]?？ń槊?bacillus calmette-guérin,BCG)是結(jié)核桿菌的減毒活疫苗，具有非特異性免疫刺激作用，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對機體具有免疫保護作用。已證實新生期小鼠接種卡介苗可以提高認(rèn)知功能，并誘導(dǎo)突觸可塑性增強及神經(jīng)發(fā)生增加[2]。同時，有文獻報道卡介苗在小鼠疾病模型中發(fā)揮神經(jīng)保護性作用，如神經(jīng)退行性疾病帕金森綜合征等[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，AD模型小鼠注射較高劑量的卡介苗，可以改善其認(rèn)知功能，這促使我們進一步探究卡介苗對AD小鼠炎癥水平的改變及接種劑量的影響。本研究擬采用D-半乳糖腹腔注射建立C57BL/6小鼠的AD模型，通過高、低劑量的卡介苗給藥，探究其對AD小鼠行為和腦內(nèi)Aβ的影響，進一步檢測炎癥因子的變化情況，為卡介苗在AD中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 12周齡的C57BL/6小鼠32只，體質(zhì)量(18±2)g，動物飼養(yǎng)在皖南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.1.2 實驗試劑及儀器 D-半乳糖(麥克林)；Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)(眾實迪創(chuàng))；TNF-α、IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒(卡爾文)；DNM-9602酶標(biāo)分析儀；一抗Aβ42小鼠(博奧森)；二抗小鼠SABC-FICT(博士德)；冰凍切片機(Thermo HM 525NX)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥 動物隨機分為對照組、AD模型組、卡介苗低劑量組和高劑量組，每組8只。除對照組外，其余各組小鼠均以腹腔注射D-半乳糖(120 mg/kg)，每日1次，連續(xù)8周，對照組腹腔注射等體積生理鹽水(NS)。卡介苗分別以低劑量(104CFU)和高劑量(105CFU)在實驗開始的0周、4周和8周通過皮內(nèi)注射給藥。

1.2.2 曠場實驗(Open-field test) 曠場為60 cm×60 cm×45 cm的空曠封閉箱子，底部以標(biāo)記線分為6小格×6小格，頂部中央安置攝像機，記錄小鼠在曠場中的自發(fā)行為，每只小鼠記錄30 min。

1.2.3 Morris水迷宮實驗(Morris-water Maze) Morris水迷宮訓(xùn)練小鼠在一個直徑為80 cm的水池內(nèi)尋找到水下的隱藏平臺。實驗共4 d，小鼠分別從四個象限面朝池壁放入水池，60 s內(nèi)找到平臺的時間記錄為逃避潛伏期，反映小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[4]。

1.2.4 ELISA檢測血清中炎癥因子水平 摘眼球取血并分離血清，檢測小鼠TNF-α和IFN-γ含量。試劑盒加樣200 μL/孔，37℃水浴2 h，加入羊抗小鼠IgG HRP，37℃水浴1 h，加入TMB顯色液，避光15 min顯色后加終止液，30 min內(nèi)用酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長記錄讀數(shù)。

1.2.5 免疫熒光染色 生理鹽水灌注后的小鼠取腦浸泡在4%的多聚甲醛溶液中充分固定后，依次浸泡于10%、20%、30%的蔗糖溶液平衡，用冰凍切片機切成40 μm的漂片，用含0.25% Triton X-100的1% BSA在 37℃ 水浴封閉30 min，抗Aβ42小鼠(1∶400)孵育2 h后4℃過夜，第二天取出加入羊抗小鼠555(1∶400)37℃ 水浴2 h，漂洗后將腦片裱于防脫載玻片上，并用甘油/PBS(1∶1)封片，激光共聚焦掃描顯微鏡拍照[5]。

2 結(jié)果

2.1 小鼠在曠場中的自主活動度 與NS對照組相比，AD小鼠在中央?yún)^(qū)域的活動性降低，直立次數(shù)低于對照組，糞粒數(shù)增多(P<0.05)，表明小鼠的自主活動和探索能力下降、焦慮水平提升。而卡介苗處理后的小鼠活動性提高(P<0.05)，高低劑量間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。表明卡介苗能夠提高AD小鼠的活動度、緩解焦慮。

表1 卡介苗對小鼠曠場自主活動的影響

注：與NS對照組相比，*P<0.05；與AD組相比，#P<0.05。

2.2 小鼠在水迷宮中的學(xué)習(xí)記憶功能 各組小鼠逃避潛伏期逐漸縮短。第3、4天，AD小鼠的逃避潛伏期長于對照組(P<0.05)，而經(jīng)卡介苗處理的AD小鼠逃避潛伏期縮短(P<0.05)(表2)，高低劑量之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示卡介苗可改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

表2 小鼠定位航行的逃避潛伏期 s

注：與NS對照組相比，*P<0.05；與AD組相比，#P<0.05。

2.3 AD小鼠腦內(nèi)的Aβ沉積 免疫熒光檢測各組小鼠腦內(nèi)Aβ沉積，結(jié)果顯示(圖1)，D-半乳糖造模的AD小鼠腦內(nèi)可檢測到Aβ斑塊，而經(jīng)卡介苗處理后，小鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊面積減少。表明卡介苗緩解了AD模型小鼠腦內(nèi)的Aβ沉積。

A～C分別為AD組、BCG低劑量組和BCG高劑量組小鼠腦內(nèi)的Aβ斑塊染色；D～F分別為A～C圖方框內(nèi)的放大圖像。

圖1 小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊的檢測

2.4 小鼠血清中炎癥因子的含量 ELISA檢測小鼠血清中TNF-α和IFN-γ的含量，結(jié)果顯示(表3)，AD模型小鼠血清中的炎癥因子TNF-α和IFN-γ高于NS對照組(P<0.05)，而卡介苗的處理抑制了外周炎癥因子的表達，表現(xiàn)為TNF-α和IFN-γ的含量下降(P<0.05)。高低劑量之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 各組小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子的含量 ng/L

注：與NS對照組相比，*P<0.05；與AD組相比，#P<0.05。

3 討論

AD是以認(rèn)知能力減退為主要特征的老年性癡呆，其病程與Aβ密切相關(guān)，同時炎癥細(xì)胞因子發(fā)生變化，非炎性神經(jīng)斑塊發(fā)展為炎性神經(jīng)斑塊[6]。D-半乳糖誘導(dǎo)AD模型是通過引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，使腦神經(jīng)元發(fā)生退行性變化，出現(xiàn)AD特征[7]。研究表明，卡介苗可以調(diào)節(jié)機體細(xì)胞免疫，影響炎癥因子等，而新生小鼠接種卡介苗可以促進其中樞神經(jīng)發(fā)生并增強突觸可塑性[2]。我們前期研究證實了AD小鼠接種卡介苗后認(rèn)知功能得到改善，在本研究中，我們進一步探索不同劑量的卡介苗對AD小鼠行為和腦內(nèi)Aβ沉積的影響，并進一步檢測小鼠血清中兩種主要的促炎因子TNF-α和IFN-γ。

結(jié)果顯示卡介苗處理的AD小鼠行為得到改善，腦內(nèi)Aβ斑塊減少，炎癥因子水平下降，提示卡介苗改善AD小鼠的病理變化可能是通過抑制AD小鼠的炎癥因子，減輕蛋白的神經(jīng)毒性來實現(xiàn)的。而高劑量和低劑量卡介苗處理的小鼠各指標(biāo)統(tǒng)計無差異。在行為學(xué)實驗中，小鼠進入曠場箱，對新環(huán)境產(chǎn)生恐懼；另一方面又喜歡探究，使其在中央?yún)^(qū)域活動并直立察看[8]。Morris水迷宮反映了空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)功能，通過逃避潛伏期來評價AD的行為學(xué)指標(biāo)。在本研究中，卡介苗處理的AD小鼠表現(xiàn)出較強的活動度和學(xué)習(xí)記憶功能，緩解癡呆癥狀。

目前普遍認(rèn)為Aβ是AD的發(fā)病原因，AD患者腦內(nèi)可檢測到Aβ斑塊[9]，經(jīng)卡介苗處理后則減少，緩解了AD的病理變化。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)能檢測到大量炎癥免疫因子，使斑塊發(fā)展為炎性神經(jīng)斑塊，加重神經(jīng)損傷[10]。臨床發(fā)現(xiàn)AD患者血液中TNF-α和IFN-γ升高[11]，因此本實驗檢測了小鼠血清中這兩種因子，發(fā)現(xiàn)AD小鼠血清中炎癥因子水平高于對照組，而經(jīng)卡介苗處理后含量下降。表明卡介苗降低了AD小鼠血清中的炎性水平。

在一系列指標(biāo)的檢測中，我們發(fā)現(xiàn)低劑量和高劑量卡介苗的處理對AD小鼠行為、斑塊及炎癥因子的改善作用并無統(tǒng)計學(xué)差異。這是因為影響免疫效果的因素很多，包括外部環(huán)境因素、疫苗使用因素等，其中免疫程序、免疫途徑、免疫劑量等均有影響。一般研究表明[12]，初次免疫通常產(chǎn)生的效應(yīng)較低，而多次重復(fù)后可有效激活細(xì)胞免疫，增強機體反應(yīng)性。同時有研究顯示低劑量卡介苗可對機體產(chǎn)生較好的免疫保護作用。因此，在本研究中，低劑量的卡介苗即可有效刺激機體免疫系統(tǒng)，而經(jīng)過重復(fù)接種，再次的免疫應(yīng)答被有效激活，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，與高劑量免疫間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，卡介苗能下調(diào)AD小鼠血清中的炎癥因子水平，減輕Aβ神經(jīng)毒性，改善AD小鼠的行為活動，可在AD治療中發(fā)揮作用。