李 強(qiáng)，齊世美，姜 琦，戚之琳，章 堯

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室;2.人體解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

炎癥反應(yīng)在組織創(chuàng)傷、感染、毒素反應(yīng)以及自身免疫性應(yīng)激損傷中，參與許多細(xì)胞生理和病理變化過程[1-3]。正常狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎介質(zhì)和促炎因子在細(xì)胞代謝和組織修復(fù)中發(fā)揮重要作用。MAPK信號(hào)通路與細(xì)胞的生長、分化、凋亡等多種重要細(xì)胞的生理和病理過程息息相關(guān)[4]。大量研究已證實(shí)MAPK信號(hào)通路的失調(diào)能導(dǎo)致多種炎癥反應(yīng)發(fā)生[5]，因此針對(duì)MAPK信號(hào)通路靶位點(diǎn)進(jìn)行研發(fā)抗炎藥物是可行的。

白楊素又名白楊黃素，具有廣泛的生物學(xué)作用，包括抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤等，該類化合物分布廣泛且毒性較低，因此是新藥開發(fā)研究中一個(gè)潛在的重要資源[6]。

盡管已經(jīng)有諸多研究報(bào)道了白楊素具有抗炎效果，但未闡明白楊素在革蘭陰性細(xì)菌表面脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及具體的抗炎作用中的機(jī)制。本研究以RAW 264.7巨噬細(xì)胞為研究模型，驗(yàn)證了白楊素的抗炎作用，并證實(shí)了白楊素可以下調(diào)MAPK信號(hào)蛋白的磷酸化，著重評(píng)估了白楊素在LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的抗炎效果，拓展了白楊素在臨床上的用藥范圍。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫購買的RAW 264.7小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系使用含10 %胎牛血清DEME完全培養(yǎng)基(Gibco)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為CO2濃度：5 %，溫度：37 ℃，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞活力值檢測 將RAW 264.7細(xì)胞每孔按照1×104個(gè)接種于96孔板，分別使用不同濃度的白楊素(購自中國阿拉丁生物試劑公司)(0、5、10、20、40、60、80、100、150、200 mg/L)孵育RAW 264.7細(xì)胞24 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，按照CCK-8(購自日本DOJINDO公司)試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光值(OD)。

1.3 活性氧簇的檢測 將1×107個(gè)RAW 264.7細(xì)胞鋪滿12孔板，使用CM-H2DCFDA熒光探針(購自中國Beyotime公司)檢測各實(shí)驗(yàn)組中 RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)活性氧簇釋放情況。

1.4 N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)抑制ROS產(chǎn)生 將2×107個(gè)RAW 264.7細(xì)胞鋪滿6孔板，LPS刺激15 min過后western blot檢測炎癥蛋白和MAPK信號(hào)通路蛋白磷酸化情況。

1.5 炎癥因子的檢測 將1×107個(gè)RAW 264.7細(xì)胞鋪滿12孔板，孵育RAW 264.7細(xì)胞24 h，使用ELISA試劑盒(R&D Systems)檢測各組TNF-α、IL-6和NO的 OD 值。

1.6 western blot 使用對(duì)數(shù)期RAW 264.7細(xì)胞進(jìn)行鋪板，孵育白楊素2 h后加入LPS刺激18 h，每孔加入120 μL含有蛋白酶抑制劑PMSF的蛋白裂解液(購自中國Beyotime公司)在冰上裂解30 min，加入120 μL 2×SDS loading buffer，水浴煮沸5 min，使用4%濃縮膠，12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜過后使用5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗(購自美國Cell Signaling Technology公司)4 ℃在水平搖床過夜，熒光二抗(購自美國LI-COR Biosciences公司)孵育1 h，PBS清洗過后，使用 Odyssey imaging system(購自美國LI-COR Biosciences公司)進(jìn)行成像觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，組間比較采用F檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白楊素對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響 為了評(píng)估白楊素對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖活力的影響，我們使用不同濃度的白楊素(0、5、10、20、40、60、80、100、150、200 mg/L)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞進(jìn)行處理，培育24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑孵育2 h，酶標(biāo)儀測A450值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白楊素在小于60 mg/L時(shí)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力沒有影響，超過該濃度可降低細(xì)胞活力(F=900.19，P<0.01)。因此我們將10、30、60 mg/L的白楊素作為RAW 264.7細(xì)胞的低、中、高劑量組。

2.2 白楊素抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng) 使用不同濃度的白楊素(10、30、60 mg/L)預(yù)孵育 RAW 264.7細(xì)胞2 h后加入100 μg/L的LPS進(jìn)行誘導(dǎo)，通過空白對(duì)照組、單加白楊素組、LPS刺激組和不同濃度白楊素(10、30、60 mg/L)+LPS實(shí)驗(yàn)組，37℃培養(yǎng)18 h后，取上清培養(yǎng)基檢測各組TNF-α、IL-6和NO的釋放情況，western blot檢測炎癥蛋白iNOS和COX-2的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞后，白楊素能抑制炎癥蛋白的表達(dá)和炎癥因子TNF-α(F=174.98，P<0.01)、IL-6(F=99.40，P<0.01)和NO(F=18.42，P<0.01)的釋放。

2.3 白楊素抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞ROS的產(chǎn)生 研究發(fā)現(xiàn)RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)LPS刺激能產(chǎn)生大量的內(nèi)源性ROS，ROS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬功能及炎癥信號(hào)的傳遞。白楊素和NAC孵育RAW 264.7細(xì)胞2 h，加入100 μg/L的LPS進(jìn)行誘導(dǎo)15 min后，使用活性氧探針CM-H2DCFDA檢測ROS的釋放情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組、NAC組、單加白楊素藥物組比較，LPS刺激組的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光增強(qiáng)，當(dāng)孵育白楊素時(shí)，ROS釋放被抑制，這說明白楊素可以有效清除LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)源性ROS蓄積。

2.4 白楊素阻斷LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞MAPK信號(hào)的活化 LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞后，能夠激活ERK、JNK、P38蛋白磷酸化，當(dāng)使用不同濃度白楊素(10、30、60 mg/L)處理RAW 264.7細(xì)胞后，MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)被抑制，見圖3、4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白楊素可以有效阻斷RAW 264.7細(xì)胞MAPK信號(hào)的活化。

A～C.白楊素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子NO、TNF-α和IL-6釋放的影響;D.白楊素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響。

圖1 白楊素抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)

A.Control;B. Chrycin(60 mg/L);C. NAC(20 mmol/L);D.LPS(100 μg/L);E.LPS(100 μg/L)+Chrycin(10 mg/L);F.LPS(100 μg/L)+Chrycin(30 mg/L);G.LPS(100 μg/L)+Chrycin(60 mg/L);H. NAC(20 mmol/L)+LPS(100 μg/L)。

圖2 白楊素抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞ROS的產(chǎn)生

圖3 白楊素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞MAKP信號(hào)通路蛋白活化的影響

2.5 ROS介導(dǎo)MAPK信號(hào)活化 NAC 是一種還原性的活性氧清除劑，可以有效清除各種細(xì)胞刺激時(shí)引發(fā)產(chǎn)生的內(nèi)源性活性氧，對(duì)異常產(chǎn)生的ROS能有效清除，可以有效減少LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞ROS的累積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白楊素可以有效抑制LPS誘導(dǎo)炎癥蛋白的表達(dá)并影響MAPK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用20 mmol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)預(yù)孵育RAW 264.7細(xì)胞2 h后，加入100 μg/L的LPS誘導(dǎo)18 h后，檢測iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)情況；同樣使用LPS誘導(dǎo)30 min后收集細(xì)胞裂解液，運(yùn)用western blot技術(shù)檢測p- ERK、p- JNK和p- P38蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5表明NAC能有效抑制炎癥蛋白表達(dá)和p- ERK、p- JNK和p- P38蛋白的活化。提示白楊素可能是通過有效清除細(xì)胞內(nèi)上游信號(hào)分子ROS進(jìn)而調(diào)控MAPK信號(hào)通路蛋白的活性而發(fā)揮抗炎作用。

圖4 白楊素對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞MAKP信號(hào)通路蛋白的影響

A.NAC對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響；B～D.NAC對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞p-ERK、p-JNK和p-P38蛋白表達(dá)的影響。

圖5 NAC對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞MAKP信號(hào)通路蛋白的影響

3 討論

白楊素衍生物能降低LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥蛋白的生成[7]，然而，白楊素在LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用的具體分子機(jī)制尚未見報(bào)道。正常情況下，炎癥相關(guān)介體NO和PGE2，主要由iNOS和COX-2酶生成，與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子在細(xì)胞代謝和組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，相關(guān)研究表明這些炎性介體和細(xì)胞因子過度產(chǎn)生伴隨著炎癥疾病[8]。因此，研究通過抑制炎癥細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)對(duì)有效的預(yù)后或診斷生物標(biāo)記物以及開發(fā)靶向治療抗炎藥物都是至關(guān)重要的[9]。

在巨噬細(xì)胞中，ROS還可以作為第二信使調(diào)節(jié)多條信號(hào)激酶級(jí)聯(lián)并激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[10-12]。本研究結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞能上調(diào)NO的產(chǎn)生，且在白楊素安全劑量范圍內(nèi)預(yù)處理可抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6 和 NO的釋放，并且呈劑量依賴性。NAC是一種還原性的活性氧清除劑，可以清除各種細(xì)胞刺激時(shí)引發(fā)產(chǎn)生的內(nèi)源性活性氧。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NAC 能抑制LPS 刺激RAW 264.7細(xì)胞引起的炎癥蛋白iNOS、COX-2的表達(dá)，且炎癥因子IL-6、TNF-α及NO的釋放同樣被抑制，這說明ROS可能是作為炎癥因子表達(dá)調(diào)控的上游信號(hào)分子。western blot分析結(jié)果顯示，RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)ROS能被白楊素有效清除，進(jìn)而說明ROS可能是白楊素抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用靶點(diǎn)。本研究的結(jié)果表明白楊素可通過減少LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞促炎分子的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)白楊素具有抗炎作用，其機(jī)理可能是通過清除細(xì)胞內(nèi)源性ROS的生成，進(jìn)而調(diào)控MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)的。本研究拓展了我們對(duì)白楊素生物學(xué)功能尤其是在抗炎方面的認(rèn)識(shí)，從而為其潛在的臨床應(yīng)用提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支撐。