章程，馮瑤，劉元望，成登苗，鄭宇，李兆君

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菠菜土壤中典型抗生素的微生物降解及細(xì)菌多樣性

章程1，馮瑤1，劉元望1，成登苗1，鄭宇2，李兆君1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)部植物營養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實驗室/中國-新西蘭土壤分子生態(tài)學(xué)聯(lián)合實驗室，北京 100081；2北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院/農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實驗室，北京 102206）

【目的】研究抗生素在土壤中殘留情況及其對土壤細(xì)菌多樣性的影響，為今后抗生素類污染物的土壤微生物修復(fù)和環(huán)境風(fēng)險評價提供依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^在種植菠菜土壤中添加抗生素的盆栽試驗，以慶大霉素和泰樂菌素及對應(yīng)功能降解微生物（慶大霉素降解真菌FZC3和泰樂菌素降解細(xì)菌無色桿菌）為研究對象，設(shè)計7個處理，分別為慶大霉素（CG）、慶大霉素+FZC3（CGF）、泰樂菌素（CT）、泰樂菌素+無色桿菌（CTW）、兩種抗生素（CM）、兩種抗生素+兩種降解菌（CMM）和空白（CC），其中慶大霉素殘留率的對比組為CG、CGF、CM和CMM處理；泰樂菌素殘留率的對比組為CT、CTW、CM和CMM處理。借助固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用及Illumina高通量測序技術(shù)，對試驗過程中抗生素殘留及其對土壤細(xì)菌多樣性影響進(jìn)行研究。【結(jié)果】添加FZC3和無色桿菌可分別顯著提高土壤中慶大霉素和泰樂菌素的去除效果，但隨著菠菜的生長，各處理間抗生素殘留率差異逐漸變小：第一周不同處理抗生素殘留率差異最為顯著，其中CMM處理中慶大霉素的殘留率最低，為53.93%；CTW處理中泰樂菌素的殘留率最低，為3.92%。第一周CGF處理比CG處理中慶大霉素殘留率下降了約3.3%，CTW處理比CT處理中泰樂菌素的殘留率降低了4.1%。同時，添加抗生素及其降解菌會不同程度影響土壤細(xì)菌豐富度和多樣性：與CC相比，CG、CTW和CMM 3個處理中土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性有顯著差異（＜0.05）。FZC3可以緩解慶大霉素對土壤細(xì)菌的抑制作用，與CC處理相比，CG處理馬賽菌和芽胞桿菌的相對豐度更高，而CGF與CC組群落結(jié)構(gòu)相似；無色桿菌對土壤細(xì)菌菌群的影響程度大于其對緩解泰樂菌素毒性抑制作用的影響，相較于CT和CC處理，CTW處理中無色桿菌的添加抑制了土壤其他細(xì)菌的生長，而CT與CC處理各屬細(xì)菌菌群相對豐度差異不顯著。CM與CC處理相比，土壤中細(xì)菌豐富度、多樣性和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均無顯著差異，表明兩種抗生素同時添加其相互間呈現(xiàn)拮抗作用?！窘Y(jié)論】土壤中慶大霉素和泰樂菌素的殘留對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有不同程度的影響。添加功能微生物可以提高兩種抗生素的去除效率，F(xiàn)ZC3添加可以緩解慶大霉素對土壤細(xì)菌的影響，而無色桿菌添加對土壤細(xì)菌菌群影響較大。

慶大霉素；泰樂菌素；抗生素降解菌；細(xì)菌多樣性；菠菜

0 引言

【研究意義】近年來，伴隨著集約化畜牧業(yè)以及配合飼料工業(yè)的發(fā)展，抗生素作為疾病防治藥物和飼料添加劑被廣泛地應(yīng)用[1]，目前我國已成為世界上生產(chǎn)和使用抗生素最多的國家[2-3]，也是抗生素濫用問題較多的國家之一[4]。由于約有40%—90%抗生素進(jìn)入動物體內(nèi)不能被完全消化吸收，導(dǎo)致大量抗生素隨畜禽糞便進(jìn)入土壤或水體環(huán)境[5]。不斷被引入農(nóng)業(yè)環(huán)境中的獸用抗生素已成為一種“假”持久性化合物，隨之不可估量的環(huán)境負(fù)效應(yīng)引起了社會廣泛關(guān)注[6-7]。因而，研究土壤中抗生素殘留狀況以及添加外源降解微生物對土壤微生物的影響，對土壤抗生素污染原位修復(fù)有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】綜合國內(nèi)外報道，畜禽糞便中抗生素殘留濃度為23—1 420 mg·kg-1[8]，土壤中的抗生素殘留濃度為0.28—10.51 mg·kg-1[9]，植物組織中獸用抗生素檢出量最高可達(dá)為14 mg·kg-1[10-11]。由于我國畜禽有機(jī)糞肥改良耕地推廣政策，土壤環(huán)境中獸用抗生素殘留量已超國外其他國家平均水平[8-9, 12-13]，其中大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類作為典型的獸用抗生素存在于土壤環(huán)境中，其殘留量最高可以達(dá)到2.07 mg·kg-1[14]。土壤環(huán)境中的殘留抗生素除了具有生物可富集性[15-16]，還可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗生素耐藥菌和抗性基因（ARGs）[17-18]?？剐曰蚩梢酝ㄟ^遺傳基因原件在各類微生物及環(huán)境中傳播，存在通過食物鏈向人體轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險[19]，抗生素及其抗性基因污染問題亟待解決。土壤細(xì)菌是土壤微生物主要組成之一，參與土壤養(yǎng)分循環(huán)并維持整個土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定。土壤細(xì)菌數(shù)量、分布范圍及其群落結(jié)構(gòu)特征和變化規(guī)律等是反應(yīng)土壤細(xì)菌群落多樣性及其生態(tài)功能的重要指標(biāo)[20]?，F(xiàn)有研究表明，外源抗生素會對土壤細(xì)菌產(chǎn)生極大的影響。孫英健等[21]發(fā)現(xiàn)阿維菌素能夠?qū)е峦寥乐形⑸锓N群數(shù)量的降低；姚建華等[7]發(fā)現(xiàn)土霉素能夠顯著降低土壤以及小麥根際的土壤酶活性；而張奇春等[22]發(fā)現(xiàn)土壤原有耐藥菌能以抗生素為碳源促進(jìn)生長繁殖?？股卦谝种破浒袠?biāo)微生物的同時，土壤中其他微生物還可以利用這些抗生素及死亡微生物來獲得碳源等進(jìn)行生長[23]。獸用抗生素在土壤中殘留特征及其對微生物多樣性影響等的研究已成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究所選用的慶大霉素（氨基糖苷類）和泰樂菌素（大環(huán)內(nèi)酯類）是我國土壤環(huán)境中殘留量較大且相對難降解的兩種抗生素[24-27]，現(xiàn)有研究僅考察了抗生素對土壤環(huán)境細(xì)菌多樣性的影響，而關(guān)于外源抗生素降解菌對土壤細(xì)菌多樣性影響鮮有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究采用盆栽試驗法，借助固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用檢測抗生素技術(shù)及Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，以慶大霉素和泰樂菌素為研究對象，揭示了外源添加抗生素及相關(guān)功能性降解菌（慶大霉素降解菌FZC3和泰樂菌素降解菌無色桿菌）在土壤中殘留規(guī)律及對細(xì)菌多樣性影響，以期為今后土壤中抗生素類污染物的高效綠色解決和抗生素污染物土壤修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

甲醇、乙腈、正己烷、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；丙酮、檸檬酸、乙酸、磷酸、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純試劑，購于廣州試劑公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺二乙酸二鈉（EDTA）（國藥集團(tuán)試劑有限公司）；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂（西隴化工股份有限公司）；實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)（Millipore，Billerica，MA，USA）過濾的超純水。

試驗用慶大霉素（Gentamycin，GM，99.99%）由山東只楚藥業(yè)提供，泰樂菌素來源于北京海格里斯公司（Tylosin，TYL，97.00%）。試驗接種的菌劑為本實驗室（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源所中國-新西蘭土壤分子生態(tài)學(xué)聯(lián)合實驗室）篩選的優(yōu)勢降解菌，慶大霉素優(yōu)勢降解真菌土曲霉FZC3和泰樂菌素優(yōu)勢降解細(xì)菌無色桿菌。真菌培養(yǎng)基為液體土豆培養(yǎng)基（LPD），細(xì)菌培養(yǎng)基為液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0—7.2后滅菌）。

1.2 材料及儀器

1.2.1 盆栽土壤采集 試驗所用土壤為華北地區(qū)典型潮土，采自河北省廊坊市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊基地休耕一年表層土，所有供試土壤均采自0—20 cm表層，經(jīng)自然風(fēng)干后研磨過5 mm篩備用。土壤理化性質(zhì)如表1所示，其中pH、電導(dǎo)率、總有機(jī)碳和總氮測定方法參考土壤農(nóng)化分析[28]。

1.2.2 儀器及耗材 慶大霉素檢測采用Agilent 1260高效液相色譜儀（HPLC, 美國）配置Alltech蒸發(fā)光檢測器2000（美國），色譜柱采用Waters Atlantis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；泰勒菌素檢測采用Agilent 1200型高效液相色譜串聯(lián)Agilent 6410三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），色譜柱采用Waters Atlantis Sunfire C18色譜柱（150 mm×4.6 mm, 3.5 μm）。LGJ-10D冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)公司），TL2020球磨儀（北京鼎昊源公司），渦旋儀（德國Wiggens公司），超聲波清洗儀（寧波新芝公司），Sigma 3K15高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司），Heidolph 2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國海道爾夫），十二孔固相萃取裝置（美國Supelco公司），PCR擴(kuò)增儀（Bio rad ALS1296型），Oasis HLB固相萃取柱（6 mL·500mg-1，美國Waters公司）和0.45 μm、0.22 μm針筒式微孔濾膜（天津津騰公司）。盆土采樣器型號為TC-601-A2，鉆頭直徑為38 mm。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 盆栽試驗 本試驗于2016年11月中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院玻璃智能溫室中進(jìn)行。由于培養(yǎng)室氣溫較低（15—22℃），因此選用北方耐冷蔬菜菠菜—菠菜一號為供試植物。兩種外源抗生素添加量為50 mg·kg-1；FZC3每千克土壤中接種量為1×108個孢子數(shù)；無色桿菌每千克土壤中接種量為1×109CFU。共設(shè)計7個處理，3次重復(fù)，詳細(xì)見表2。

表1 試驗用土壤基本理化性質(zhì)

表2 不同處理名稱及其對應(yīng)添加內(nèi)容

1.3.2 具體實施與樣品采集 外源抗生素及外源菌劑添加：培養(yǎng)盆采用長寬高分別為30 cm×15 cm×20 cm黑色亞克力板粘合的箱體，將同處理的風(fēng)干土平鋪于塑料布上，用噴霧器噴灑抗生素標(biāo)液、液體微生物菌劑，同時不斷翻攪，使土壤與抗生素、菌劑充分混勻（為避免其他因素干擾，本次試驗未施肥），加水調(diào)節(jié)土壤濕度為田間持水量的65%，隨后分裝于3個培養(yǎng)盆中，每盆裝土量為8 kg。

菠菜栽種：挑選完整飽滿的菠菜種子，放置于70%的酒精中表面消毒30 min，接著用大量超純水沖洗10 min后置于培養(yǎng)皿中潤濕濾紙上，在人工培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3 d（日溫20℃，夜溫18℃，濕度為60%），挑選生長均一的菠菜苗移栽于盆土中，每盆中平行定植12株菠菜苗，之后正常澆水，維持土壤濕度為田間持水量的65%。11月的玻璃智能溫室中自然日照時長為6.4 h，溫室內(nèi)人工補(bǔ)光12 h（8：00—20：00），日溫20—22℃，夜溫15—17℃，空氣相對濕度為47%—55%，盆土溫度一般維持在（15±0.73）℃。冬季菠菜生長周期大約是45—55 d，因而將培養(yǎng)周期按周定為處理后第8周（56 d）。

菠菜樣品采收：56 d后將菠菜整株從土壤中分離進(jìn)行表面清洗，并分為地上和地下部分，避光充分冷凍干燥后研磨過2 mm篩并避光密封保存于-20℃冰箱中，待提取。

土壤樣品采集：分別在第0、7、14、28、42和56天進(jìn)行采樣，即在同一盆中隨機(jī)選取3點(diǎn)利用盆土采樣器縱向采集土壤樣品（避開菠菜根系范圍）并混合均勻，每份樣品采樣量為（4.5±0.3）g，采集后通過松土及澆水使土壤土層恢復(fù)平整。然后將采集的樣品放于-80℃超低溫冰箱中保存待測。其中第7天和14天取土樣1 g進(jìn)行細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析。

1.4 抗生素測定方法

土壤中慶大霉素的提取方法為732樹脂-氨水法，用液相色譜-蒸發(fā)光檢測器檢測[26]，慶大霉素液相方法流動相：0.2 mol·L-1的三氟乙酸/甲醇=92/8（V/V）；土壤中泰勒菌素的提取方法為固相萃取EDTA- McIlvaine法，通過液質(zhì)聯(lián)用方法進(jìn)行測定[29]，泰樂菌素初始流動相：0.1%甲酸水/乙腈=80﹕20（V/V）。

慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.010 g藥品，用超純水定容于100 mL容量瓶中，配置成100 mg·L-1的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.010 g，加入少量甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成100 mg·L-1的泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。標(biāo)準(zhǔn)液（0.1、0.5、1、5、10 mg·L-1）均由儲存標(biāo)樣加甲醇稀釋配制而成。以上標(biāo)準(zhǔn)儲備液均保存于4℃冰箱中。

提取慶大霉素試劑配制。（1）4.5%氨水：量取氨水197.8 mL，用超純水稀釋至1 000 mL，混勻；（2）0.2 mol·L-1的三氟乙酸：量取14.85 mL的三氟乙酸定容于1 L超純水中。

提取泰樂菌素試劑配制。（1）EDTA-McIlvaine緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取21.0 g檸檬酸和28.4 g無水磷酸氫二鈉，分別用超純水溶解并定容至1 L，制成0.1 mol·L-1檸檬酸溶液以及0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液，兩種溶液按8﹕5（V/V）比例混合，配制成McIlvaine緩沖液。稱取37.2 g EDTA-二鈉溶解于1 L McIlvaine溶液中，配得0.1 mol·L-1EDTA-McIlvaine緩沖液，用HCl或者NaOH調(diào)節(jié)pH為4.0[30-32]。（2）有機(jī)混合提取劑：量取一定量的甲醇、乙腈、丙酮按照2﹕2﹕1（V/V/V）比例混合配制而成，用H3PO4調(diào)節(jié)pH為4.0。

1.5 土壤樣品總DNA的提取及高通量測序

采用強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.），按其操作手冊提取土壤樣品微生物基因組DNA。本試驗擴(kuò)增PCR反應(yīng)所采用的引物由北京奧維森基因科技有限公司合成。細(xì)菌的引物對為336F（5’-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），此引物用來擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)。

PCR反應(yīng)體系總體積均為50 μL。30 ng 所提取樣品DNA，10×buffer 5 μL，DNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.3 μL，正反向引物（10 μmol·L-1）各2 μL，dNTP Mix 4 μL，ddH2O 36.7 μL。擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性5 min；25個普通PCR循環(huán)，具體為95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s；循環(huán)結(jié)束后72℃充分延伸10 min。每組PCR擴(kuò)增過程中設(shè)立一個陰性對照，除不加DNA樣品外，其余反應(yīng)組成相同。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠EB染色，在150 V下電泳30 min，用BIO-RAD紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測，拍照。參照電泳初步定量結(jié)果，用Qubit熒光定量系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測之后，根據(jù)每個樣本的測序量要求以及定量結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。樣品純化后送至北京奧維森通過Illumina平臺的MiSeq進(jìn)行測序（CA, USA）。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

1.6.1 常規(guī)數(shù)據(jù)分析 土壤中慶大霉素和泰樂菌素的殘留率計算公式：

R(%)=t/0×100 （1）

式中，R為抗生素的殘留率；0為抗生素起始濃度（mg·kg-1），t為時間時間殘留的抗生素濃度（mg·kg-1）。

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2016及SPSS 20軟件，圖表繪制采用Origin 8.5軟件。

1.6.2 高通量測序數(shù)據(jù)分析 本試驗采用Illumina MiSeq平臺的雙端（Paired-end）測序。首先對測得的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本降噪處理，首先過濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基和長度50 bp以下的reads，最終獲得高質(zhì)量的reads[33]；然后通過FLASH軟件將成對的序列拼接成一條序列。要了解一個樣品測序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對序列進(jìn)行歸類操作（cluster）。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組就是一個OTU。通過UPARSE 7.1按照97%相似性對序列進(jìn)行OTU聚類，得到OUT表及去除嵌合體的有效代表序列[34]。最后采用RDP Classifier算法對代表序列進(jìn)行比對分析，并在各水平（kingdom, phylum, class, order, family, genus, species）注釋其群落的物種信息。并利用mothur軟件計算細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)Chao1以及多樣性指數(shù)Shannon，采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析[35]。

Chao1指數(shù)計算公式：

chao1=obs+1(1-1)/2(2+1) （2）

式中，chao1指估計的OTU數(shù)，obs指實際觀測到的OTU數(shù)，1指只含有一條序列的OTU數(shù)目，2指只含有兩條序列的OTU數(shù)目。

Shannon指數(shù)計算公式：

式中，H代表shannon多樣性指數(shù)，obs指實際觀測到的OTU數(shù)，n指每個OUT包含的序列數(shù)，指所有序列之和。

2 結(jié)果

2.1 不同處理土壤中抗生素的殘留

土壤中慶大霉素濃度隨時間的變化情況如表3所示，空白對照組（CC）中始終無慶大霉素檢出。由表中可知，第0天（摻藥并定植菠菜當(dāng)天定義為處理第0天）時，各處理組中所檢測到的抗生素含量為40.087—40.796 mg·kg-1，加藥濃度為50 mg·kg-1，因而摻藥及降解菌后潮土中慶大霉素的回收率為80.17%—81.59%，且處理組間無顯著差異性。第7—14天時，各處理組中慶大霉素含量之間有顯著性差異；第28—56天時，各處理組中慶大霉素含量之間漸無差異。

不同時期各處理土壤中慶大霉素的殘留情況如圖1所示。以0 d各處理殘留濃度為初始濃度，按照公式1計算得到不同時期不同處理中慶大霉素的殘留率。隨著菠菜的生長，各處理慶大霉素平均殘留率從第7天的56.62%下降到第56天的1.66%，表明菠菜種植過程中慶大霉素可以被有效得去除掉。對比第7、14和28天加菌處理和不加菌處理發(fā)現(xiàn)，加菌后土壤慶大霉素的殘留率顯著低于未加菌處理；比較不同時期處理CGF和CG處理中慶大霉素殘留率發(fā)現(xiàn)，除第56天外，CGF處理中慶大霉素殘留率顯著低于CG處理中的殘留率，表明添加FZC3可以提高慶大霉素的去除效率。比較不同時期處理CG和CM發(fā)現(xiàn)，兩個處理中慶大霉素殘留率差異不明顯（＞0.05），表明土壤中同時添加兩種抗生素并沒有對慶大霉素的去除造成影響。比較不同時期CMM和CM處理發(fā)現(xiàn)，CMM處理中慶大霉素殘留率均比CM處理中顯著降低（＜0.05），表明慶大霉素和泰樂菌素同時存在時，添加兩種外源降解菌可以促進(jìn)土壤中慶大霉素的去除。

表3 不同時期不同處理土壤中的慶大霉素的殘留濃度（mg·kg-1）

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）；同列數(shù)值平均值后不同的小寫字母表示處理間存在顯著差異（＜0.05）。CGF：慶大霉素+慶大霉素降解菌FZC3；CG：慶大霉素；CMM：慶大霉素+慶大霉素降解真菌FZC3+泰樂菌素+泰樂菌素降解細(xì)菌無色桿菌；CM：慶大霉素+泰樂菌素；CC：空白對照組

Data are average ± standard deviation (n=3); Different lowercase letters after average values represent significant differences between different treatments (＜0.05). CGF: Add with GM+ FZC3 (GM-degrading fungi); CG: Add with GM; CMM: Add with GM + FZC3 + TYL +(TYL- degrading bacteria); CM: Add with GM + TYL; CC: Blank control

數(shù)據(jù)為平均殘留率±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）；不同小寫字母表示同一時期不同處理中抗生素殘留率之間存在顯著差異（P＜0.05）

土壤中泰樂菌素濃度隨時間的變化情況如表4所示，CC處理中始終無泰樂菌素檢出。第0天各處理組中所檢測到的抗生素含量為42.810—44.087 mg·kg-1，加藥濃度為50 mg·kg-1，因而摻藥及降解菌后潮土中泰樂菌素的回收率為85.62%—88.17%，處理組間無顯著差異性。7 d各處理組中泰樂菌素含量之間有顯著性差異，而第14—56天時，各處理泰樂菌素含量之間顯著性差異逐漸變小。

表4 不同時期不同處理土壤中的泰樂菌素的殘留濃度(mg·kg-1）

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（=3）；同列數(shù)值平均值后不同的小寫字母表示處理間存在顯著差異（＜0.05）。CTW：泰樂菌素+泰樂菌素降解菌無色桿菌；CT：只添加泰樂菌素；CMM：慶大霉素+慶大霉素降解真菌FZC3+泰樂菌素+泰樂菌素降解細(xì)菌無色桿菌；CM：慶大霉素+泰樂菌素；CC：空白對照組

Data are average ± standard deviation (=3); Different lowercase letters after average values represent significant differences between different treatments (＜0.05). CTW: Add with TYL +(TYL-degrading bacteria); CT: Add with TYL; CMM: Add with GM + FZC3 + TYL +(TYL- degrading bacteria); CM: Add with GM + TYL; CC: Blank control

數(shù)據(jù)為平均殘留率±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）；不同小寫字母表示同一時期不同處理中抗生素殘留率之間存在顯著差異（P＜0.05）

圖2為不同時期各處理土壤中泰樂菌素的殘留情況。以第0 天各處理殘留濃度為初始濃度，按照公式1計算得到不同時期不同處理中泰樂菌素殘留率。隨著菠菜的生長，各處理泰樂菌素平均殘留率從第7天8.25%下降到第56天0.1%，表明菠菜種植過程中泰樂菌素可被有效去除。對比第7天和第14天加菌和不加菌處理發(fā)現(xiàn)，加菌后土壤泰樂菌素殘留率顯著低于未加菌處理：其中第7天各處理間（CTW、CT、CMM和CM）泰樂菌素殘留率差異最為顯著（＜0.05），分別為3.92%、8.00%、8.89%、12.19%；比較不同時期CTW和CT處理泰樂菌素殘留率發(fā)現(xiàn)，除了第56天外，CTW處理泰樂菌素殘留率比CT處理顯著降低，表明添加外源降解菌可以顯著提高土壤中泰樂菌素去除效果。比較第7天CT和CM處理發(fā)現(xiàn)，前者泰樂菌素殘留率明顯比后者低，表明當(dāng)土壤中存在慶大霉素時泰樂菌素的去除效果受到影響。比較不同時期CMM和CM處理發(fā)現(xiàn)，第7天前者泰樂菌素殘留率明顯比后者低，而之后兩者差異逐漸減小，表明慶大霉素和泰樂菌素同時存在時，添加兩種外源降解菌在盆栽種植初期可以促進(jìn)土壤中泰樂菌素的去除，但隨著種植時間的推移，該作用逐漸減小。

2.2 不同處理土壤微生物群落豐富度和多樣性

研究發(fā)現(xiàn)，外源菌劑在土壤[36]或堆體中[26]活躍期為1—2周，因而本研究選取前兩周（0—14 d）土壤樣品進(jìn)行細(xì)菌多樣性檢測，以探究外源抗生素降解菌在去除抗生素的同時對土壤中細(xì)菌的影響。表5所示為各處理第1周（第7天）和第2周（第14天）的細(xì)菌群落豐富度（Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon）。各處理第2周和第1周細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)變化不一。其中CC和CT處理第2周細(xì)菌豐富度和多樣性與第1周相比均未有顯著變化；CGF處理第2周較第1周細(xì)菌豐富度和多樣性均顯著下降；CG和CTW處理第2周較第1周細(xì)菌的豐富度和多樣性均顯著增加；CMM和CM處理中第2周較第1周細(xì)菌的豐富度變化不顯著，而細(xì)菌多樣性有顯著增長。

表5 不同處理土壤中的細(xì)菌豐富度及多樣性指數(shù)

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）；同種指數(shù)平均值后不同的小寫字母表示各處理在同一周內(nèi)和兩周間都存在顯著差異（＜0.05）

Data are average ± standard deviation (=3); Different lowercase letters after average values of one index represent significant differences of different treatments within one week and between two weeks (＜0.05)

對比CGF、CG和CC處理，第1周CG與CC處理細(xì)菌豐富度和多樣性均較低，第2周兩個處理的細(xì)菌豐富度和多樣性基本一致，表明初期慶大霉素對土壤中細(xì)菌的生長有明顯影響，而可能由于慶大霉素的降解以及耐藥菌的形成，第2周時兩個處理間差異減小；第1周時CGF組土壤中細(xì)菌豐富度及多樣性均高于CG組，而第2周時CGF組細(xì)菌豐富度及多樣性指數(shù)均低于CG組。

對比CTW、CT和CC處理，第1周和第2周CT與CC處理細(xì)菌豐富度與多樣性指數(shù)均差異較小，表明土壤中添加泰樂菌素后對其中的細(xì)菌豐富度和多樣性影響較小。與CT處理相比，CTW處理細(xì)菌豐富度與多樣性指數(shù)均顯著降低，表明泰樂菌素外源降解菌會導(dǎo)致土壤中細(xì)菌豐富度和多樣性的降低。

對比CMM、CM和CC處理，第1周和第2周CM與CC處理細(xì)菌豐富度與多樣性均相差較小，可能是因為兩種抗生素產(chǎn)生了拮抗效應(yīng)，減小了對細(xì)菌的抑制作用；CMM處理的細(xì)菌豐富度與多樣性指數(shù)均少于CM處理，表明兩種降解菌的添加會使土壤中細(xì)菌的豐富度和多樣性的降低。

2.3 不同處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 門分類水平 圖3是不同處理在門分類水平上細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)變化，圖3-A為第1周，圖3-B為第2周。各處理組主要有4個優(yōu)勢細(xì)菌類群，分別是變形菌門（）、放線菌門（）、厚壁菌門（）和綠彎菌門（），這4個優(yōu)勢細(xì)菌門在所有處理中平均相對豐度值分別為38.93%、26.32%、10.72%和6.14%。對比CC處理兩周變化發(fā)現(xiàn)，第2周較第1周厚壁菌門相對豐度增加8.4%，而綠彎菌門相對豐度下降7.0%。

對比CGF、CG和CC處理，第1周CG與CC處理變形菌門、放線菌門和綠彎菌門相對豐度分別下降15.9%、13.1%和4.2%，厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度分別上升25.3%和9.8%，說明慶大霉素對變形菌門和放線菌門有較大的抑制作用；而第2周CG與CC處理群落結(jié)構(gòu)相近，可能是因為慶大霉素的降解降低了其對細(xì)菌群落的抑制效應(yīng)。相較于CG處理，第1周CGF處理中變形菌門和放線菌門相對豐度分別增加16.1%和9.7%，厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度分別下降26.7%和8.8%；但CGF與CC處理相差較小，說明慶大霉素降解菌FZC3可緩解慶大霉素對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。第2周時CGF和CG處理均與CC處理群落結(jié)構(gòu)相近，說明土壤中添加慶大霉素及其降解菌后一段時間不會對土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)造成顯著影響。

對比CTW、CT和CC處理，第1周和第2周CT與CC處理細(xì)菌菌群組成結(jié)構(gòu)及變化均相似，說明土壤中添加泰樂菌素對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較小。第1周CTW組與CT組相比變形菌門和厚壁菌門相對豐度分別增加4.0%和10.2%，綠彎菌門和酸桿菌門（）相對豐度分別下降6.3%和2.8%，說明泰樂菌素降解菌無色桿菌加入使得變形菌門相對豐度顯著上升并對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)造成影響；相較于CT處理，第2周CTW處理變形菌門相對豐度增高11.2%，厚壁菌門相對豐度下降4.5%，說明土壤中添加泰樂菌素及其降解菌后一段時間內(nèi)會對土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)造成持續(xù)影響。

對比CMM、CM和CC處理，第1周和第2周CM處理中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均與CC處理相近，說明同時添加慶大霉素和泰樂菌素藥效間產(chǎn)生拮抗作用；相較于CT處理，第1周CMM處理變形菌門相對豐度增加11.0%，綠彎菌門下降約3.9%。相較于CT處理，第2周CMM處理變形菌門提高3.9%，厚壁菌門降低3.3%，說明兩種抗生素及其降解菌加入對土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)影響顯著。

2.3.2 屬分類水平 圖4是不同處理屬分類水平上的細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)，圖4-A為第1周，圖4-B為第2周。除了沒有被分類的菌屬（undentified）和其他（others）之外，土壤中相對豐度較大的細(xì)菌菌屬分別為芽胞桿菌屬（）、鞘氨醇單胞菌屬（）、節(jié)細(xì)菌屬（）、無色桿菌屬（）、微小桿菌屬（）、乳酸桿菌屬（）和馬賽菌屬（），這7個優(yōu)勢細(xì)菌屬在所有處理中平均相對豐度值分別為3.19%、5.53%、2.69%、3.32%、2.64%、2.47%和1.79%。對比CC處理兩周變化發(fā)現(xiàn)，第2周比第1周芽胞桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和乳酸桿菌屬相對豐度分別增長2.4%、1.6%和2.3%，而馬賽菌屬、節(jié)細(xì)菌屬的相對豐度分別減少1.8%和4.5%。

圖3 不同處理門分類水平上的細(xì)菌群落分布比較（A：第1周；B：第2周）

圖4 不同處理屬分類水平上的細(xì)菌群落分布比較（A：第1周；B：第2周）

對比CGF、CG和CC處理，第1周CG較CC處理馬賽菌屬、芽胞桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬和鞘氨醇單胞菌屬相對豐度會分別下降3.2%、1.2%、2.5%和1.9%，乳酸桿菌屬相對豐度增加11.2%，說明乳酸桿菌屬是耐慶大霉素菌屬，而馬賽菌屬、芽胞桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬和鞘氨醇單胞菌屬對慶大霉素較為敏感；第2周CG處理馬賽菌屬、芽胞桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬相對豐度比第1周分別增加0.6%、3.2%和2.5%，乳酸桿菌和節(jié)細(xì)菌屬相對豐度分別減少9.5%和2.4%（節(jié)細(xì)菌屬變化趨勢與空白對照相似），且CG與CC處理群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于相似，說明慶大霉素殘留率的下降降低了其對屬分類水平細(xì)菌群落的干擾；相較于CG處理，第1周CGF芽孢桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和節(jié)細(xì)菌屬的相對豐度分別增加0.3%、1.2%和2.4%，乳酸桿菌屬相對豐度下降11.3%，且CGF與CC處理群落結(jié)構(gòu)相近，表明慶大霉素降解菌FZC3可緩解慶大霉素對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響；第2周CGF和CG處理均與CC處理群落結(jié)構(gòu)相近，說明土壤中添加慶大霉素及其降解菌后一段時間不會對土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)造成顯著影響。

對比CTW、CT和CC處理發(fā)現(xiàn)，第1周CT較CC處理馬賽菌屬相對豐度下降2.0%，鞘氨醇單胞菌屬相對豐度增加1.8%，說明鞘氨醇單胞菌屬是耐泰樂菌素菌屬，而馬賽菌屬對泰樂菌素較為敏感；CT處理第2周與第1周相比細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與CC處理變化相似，而CT與CC處理馬賽菌屬相對豐度由第1周2.0%降為1.1%，說明泰樂菌素殘留率的下降降低了其對屬分類水平細(xì)菌群落的干擾。第1周CTW較CT處理無色桿菌屬和乳酸桿菌屬相對豐度分別增加13.7%和6.4%，馬賽菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和節(jié)細(xì)菌屬相對豐度分別下降1.1%、2.2%和1.5%，說明泰樂菌素降解菌無色桿菌對屬分類水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較大；第2周CTW處理無色桿菌屬和相對豐度分別比CT提高11.9%和11.8%，而乳酸桿菌屬相對豐度差值由第1周6.4%降為-0.7%，說明第2周CTW處理群落結(jié)構(gòu)與CT處理差異顯著，而CT與CC處理第2周群落結(jié)構(gòu)相近，表明泰樂菌素降解菌無色桿菌比泰樂菌素對屬分類水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響更為顯著。

對比CMM、CM和CC處理發(fā)現(xiàn)，第1周和第2周CM處理中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與CC處理差異較小，說明同時添加慶大霉素和泰樂菌素藥效間產(chǎn)生了拮抗作用；第1周CMM較CM處理無色桿菌屬相對豐度增加14.7%，而下降的菌屬分布在未被分類的菌屬中，第2周CMM處理無色桿菌和相對豐度比CM處理分別提高3.5%和3.4%，說明泰樂菌素降解菌無色桿菌的加入顯著提高的競爭力。

3 討論

3.1 抗生素在土壤中的殘留

李孟陽[27]通過培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土壤中泰樂菌素初始濃度分別為2 000、1 000和500 mg·kg-1時，7 d后其殘留率分別為10%、17%和20%左右。本研究中當(dāng)菠菜土壤中泰樂菌素初始濃度為50 mg·kg-1時，7 d后的殘留率為8%，而添加泰樂菌素降解菌處理中其殘留率能降為3%左右。這表明土壤中泰樂菌素初始濃度會影響其在土壤中的去除效果，而植物和泰樂菌素降解菌無色桿菌可以有效促進(jìn)土壤中泰樂菌素的降解[37]。章明奎等[38]通過培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度（1、5和20 mg·kg-1）的泰樂菌素在試驗初期（20 d內(nèi)）降解速率明顯高于后期（50—100 d），與本試驗得出泰樂菌素前期（前7 d）殘留率下降速度顯著高于后期（14—56 d）的結(jié)果相似。

當(dāng)種植菠菜土壤中慶大霉素初始濃度為50 mg·kg-1時，14 d后殘留率已降為21.96%，而添加慶大霉素降解菌FZC3后其殘留率可顯著降為19.64%，說明土壤中添加慶大霉素降解菌FZC3可以顯著提高慶大霉素的去除效果，與堆肥中FZC3對慶大霉素顯著去除效果一致[26]。

比較兩種抗生素在盆栽試驗中的去除效果發(fā)現(xiàn)，慶大霉素去除效率較泰樂菌素低，尤其7 d后各處理慶大霉素的殘留率為56.62%，而泰樂菌素的殘留率為8.25%，這可能與泰樂菌素較易光解的性質(zhì)有關(guān)[39]。同時添加兩種抗生素，泰樂菌素去除效果受到較大影響而慶大霉素影響不大，這可能是因為慶大霉素對土壤中泰樂菌素降解菌產(chǎn)生了抑制作用，而7 d后CM和CT處理間泰樂菌素殘留率差異不明顯，可能是因為隨著慶大霉素的去除，其對泰樂菌素降解菌的影響逐漸減小所致。土壤中添加兩種抗生素及其降解菌后，前期（前7 d）均促進(jìn)兩種抗生素的去除，但隨著菠菜的生長，該作用逐漸減小，這與堆肥中添加外源降解菌后抗生素降解特點(diǎn)一致[26, 29]。

3.2 土壤細(xì)菌的多樣性

多樣性指數(shù)是評價細(xì)菌群落多樣性的重要指標(biāo)，多樣性指數(shù)越高表明細(xì)菌群落的豐富度和多樣性越高。Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)分別表示細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。本試驗中CC處理Chao1和Shannon指數(shù)分別為1870±33和8.70±0.07，與汪峰[40]研究中潮土的Chao1和Shannon指數(shù)相近。比較不同處理第2周和第1周細(xì)菌Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)變化特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，只有CGF處理細(xì)菌豐富度和多樣性顯著下降（Chao1和Shannon指數(shù)分別下降153和0.3），這表明該時期內(nèi)慶大霉素降解真菌FZC3對土壤中細(xì)菌群落豐富度和多樣性有顯著的抑制作用。

第1周CGF處理細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)與CG處理相比分別高123和1.2，第2周CGF處理與CG處理相比分別降低92和0.1，這可能是因為初期添加慶大霉素降解真菌FZC3而減少慶大霉素對細(xì)菌的抑制作用，因此CGF處理細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)較高；而隨著后期兩個處理慶大霉素殘留差異減小，慶大霉素降解真菌與土壤中細(xì)菌的資源競爭逐漸激烈，導(dǎo)致CGF處理細(xì)菌豐富度和多樣性比CG處理要低。第1周CTW處理比CT處理細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)分別低212和1.6，第2周分別低116和0.8，而CT組與CC組細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)無顯著差異，說明泰樂菌素降解細(xì)菌會顯著干擾土壤細(xì)菌群落原有的動態(tài)平衡。而第1周和第2周CM處理土壤中細(xì)菌豐富度和多樣性與CC處理相比均無顯著變化，可能是土壤中同時添加兩種抗生素對土壤細(xì)菌菌群存在有互相干擾（拮抗作用），而毛書帥[41]的研究也有類似結(jié)果。

3.3 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

細(xì)菌是土壤微生物的主要組成之一，參與土壤養(yǎng)分循環(huán)并維持整個土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[33]。本試驗采用16S rDNA高通量測序技術(shù)對土壤樣品進(jìn)行檢測，在97%相似度條件下，所得OTUs涵蓋了土壤中90%以上的細(xì)菌，其中包括52個門分類水平和484個屬分類水平上的細(xì)菌類群。其中優(yōu)勢門類分別是變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠彎菌門（Chloroflexi）。優(yōu)勢屬類群分別是芽胞桿菌屬（）、鞘氨醇單胞菌屬（）、節(jié)細(xì)菌屬（）、無色桿菌屬（）、微小桿菌屬（）和乳酸桿菌屬（）。試驗結(jié)果與楊亞東等[42]對不同類型農(nóng)田土壤中細(xì)菌優(yōu)勢類群的調(diào)查結(jié)果相似，但不同土壤類型、不同試驗環(huán)境及不同作物會導(dǎo)致細(xì)菌各類群的相對豐度值有一定偏差。

比較添加兩種抗生素對土壤細(xì)菌菌群的影響發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌門分類水平下，第1周CG處理比CC處理中變形菌門和放線菌門的相對豐度均顯著降低，而CT與CC處理無顯著差異，這是由于本試驗條件下慶大霉素對細(xì)菌門分類水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響較泰樂菌素較強(qiáng)的緣故；第2周后CG和CT處理均與CC處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似，這可能是由于抗生素對土壤中細(xì)菌菌群的影響作用隨菠菜的生長逐漸減小所致。在細(xì)菌屬分類水平下，第1周CG較CC處理馬賽菌屬、芽胞桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬和鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度均顯著降低，而CT與CC處理相比只有馬賽菌屬相對豐度顯著降低，這也表明屬分類水平下土壤細(xì)菌群落受慶大霉素的影響比泰樂菌素的更大。第2周后CG和CT處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均趨于相似，隨著菠菜的生長，抗生素對土壤中細(xì)菌菌群的影響均隨抗生素在土壤中殘留率的降低而減小。

通過分析CGF、CG和CC處理門和屬分類水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和慶大霉素殘留特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，相較于CG處理，第1周CGF與CC處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為相似，且CGF處理慶大霉素殘留明顯比CG處理明顯降低，這表明慶大霉素降解真菌FZC3可以通過提高土壤中慶大霉素的去除效率來緩解慶大霉素對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。第2周CGF與CC處理門分類水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)極為相近，而細(xì)菌群落的豐富度和多樣性顯著下降，這表明慶大霉素降解真菌對各門細(xì)菌的抑制作用較為一致。比較第1周CTW、CT和CC處理門和屬分類水平下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和泰樂菌素殘留特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，CT與CC處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為相似，而CTW處理泰樂菌素殘留率明顯比CT處理要低，且第2周CTW處理無色桿菌屬和的相對豐度顯著高于CT和CC處理，這表明泰樂菌素降解菌雖能顯著提高泰樂菌素的去除效率，但相較于泰樂菌素的殘留其對細(xì)菌菌群影響更大。

通過對比分析CM和CC處理門和屬分類水平下的細(xì)菌菌群和抗生素殘留特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，第1周和第2周CM與CC處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和細(xì)菌豐富度與多樣性指數(shù)均無顯著差異，這表明同時添加兩種抗生素對細(xì)菌菌群無顯著影響，可能是由于慶大霉素和泰樂菌素兩種抗生素藥效之間有拮抗效應(yīng)，這與毛書帥等[41]的研究結(jié)果類似。

4 結(jié)論

4.1 種植菠菜過程中土壤慶大霉素和泰樂菌素可以得到有效去除。其中泰樂菌素的去除效率顯著高于慶大霉素，且添加抗生素降解菌可顯著提高抗生素的去除效果。

4.2 慶大霉素和泰樂菌素均影響土壤細(xì)菌群落，其中慶大霉素的影響作用強(qiáng)于泰樂菌素；兩種抗生素同時添加時呈現(xiàn)拮抗作用，對土壤細(xì)菌群落的影響低于單一添加抗生素處理；隨著菠菜的生長，抗生素對土壤中細(xì)菌菌群的影響逐漸減小。

4.3 慶大霉素降解真菌FZC3可以緩解慶大霉素對細(xì)菌菌群的抑制作用，但對細(xì)菌豐富度和多樣性等有一定的抑制作用；泰樂菌素降解菌無色桿菌的添加對土壤細(xì)菌群落有較大影響。

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（責(zé)任編輯 李云霞）

The Degradation of Typical Antibiotics and Their Effects on Soil Bacterial Diversity in Spinach Soil

ZHANG Cheng1, FENG Yao1, LIU YuanWang1, CHENG DengMiao1, ZHENG Yu2, LI ZhaoJun1

(1Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer, Ministry of Agriculture/China-New Zealand Joint Laboratory for Soil Molecular Ecology, Beijing 100081;2Food Science and Engineering College, Beijing University of Agriculture/Beijing Key Laboratory of Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residues in Agricultural Products, Beijing 102206)

【Objective】 To provide an efficiently and eco-friendly solution for elimination of antibiotics in the soils and find a foundation for the evaluation of antibiotics contaminated land, this study was carried out about the residue of antibiotics in soils and their impacts on the abundance, diversity and composition of soil bacterial community. 【Method】 In this study, two types of antibiotics (gentamicin and tylosin) and two antibiotic-degrading microbe (a fungus namedFZC3 to degrading gentamicin, a bacterium namedto degrading tylosin) were selected to mix in spinach-growing soil. There were 7 treatments in total, including gentamicin (CG), gentamicin and FZC3 (CGF), tylosin (CT), tylosin and(CTW), two antibiotics (CM), two antibiotics and their degrading microbe (CMM), and blank control (CC). Solid phase extraction and HPLC-MS/MS technology were employed to study the impacts of degrading-microbe on antibiotics. The interactive influence of antibiotics and their degrading-microbe on soil bacterial community were studied by Illumina high-throughput sequencing technologies. 【Result】 Antibiotic-degrading microbe could improve the removal of the two antibiotics in the soil, but as time went by, the differences in the residual rates of antibiotics among all the treatments gradually minimized. During the entire test period, the differences of antibiotics residual rates between treatments were most significant in the first week. Under the CMM treatment, which spiked with two antibiotics and their degrading microbe, the residual rate of gentamicin was lowest (53.93%). Under the CTW treatment, which only spiked tylosin and, the residual rate of tylosin was as low as 3.92%. In the first week, the residual rate of gentamicin under the CGF treatment (spiked with gentamicin and FZC3) decreased about 3.3% compared with the CG treatment (spiked with gentamicin), and the residual rate of tylosin under the CTW treatment decreased about 4.1% compared with the CT treatment (spiked with tylosin). According to the results of high-throughput sequencing, there were significant differences (＜0.05) between the bacterial richness and diversity in the three treatments of CG, CTW and CMM, compared with CC. Comparing the samples of the first week, the relative abundances of,and etc. under the CG treatment were significantly lower than those in CC treatment; the relative abundance ofin CT treatment was significantly lower than that in the CC treatment; but the decrease of inhibitory effects of antibiotics on these bacteria in the second week, indicating that gentamicin and tylosin in the early period of pot experiment had a greater impacts on soil bacterial communities. The bacterial community structure under the CGF treatment was similar to that under the CC treatment within the fortnight, indicating that gentamicin-degrading fungus FZC3 could alleviate the inhibitory effects of gentamicin on bacteria. In contrast with CT treatment, the relative abundance ofwas significantly increased while other genus decreased under the CTW treatment, indicating that the tylosin-degrading bacteria had a greater impact on the bacterial community structure. There was no significant difference in bacterial richness, diversity and community structure within fortnight between CC treatment and CM treatment (spiked with two antibiotics), indicating that there might be an antagonistic effect in soil bacteria when gentamicin and tylosin were added simultaneously. 【Conclusion】 Residues of gentamicin and tylosin in soil had different degrees of influence on bacterial abundance, diversity, and structure in soils. The addition of exogenous antibiotic-degrading microbe would not only speed up the removal efficiency of the two antibiotics, but also alleviate the effect of antibiotics on soil bacterial communities to some extent.

gentamicin; tylosin; antibiotic-degrading microbe; bacterial diversity; spinach

2018-03-13；

2018-04-27

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2017YFD0801304）、國家自然科學(xué)基金（31772395）

章程，E-mail：zcmyself910905@126.com。 通信作者李兆君，Tel：010-82108657；E-mail：lizhaojun@caas.cn