戰(zhàn)帥帥，白璐，謝磊，夏先春，任毅，呂文娟，曲延英，耿洪偉

?

小麥阿拉伯木聚糖阿魏酸?；D移酶基因的 克隆與功能標記開發(fā)

戰(zhàn)帥帥1，白璐2，謝磊1，夏先春3，任毅1，呂文娟1，曲延英1，耿洪偉1

（1新疆農業(yè)大學農學院/新疆農業(yè)大學生物技術重點實驗室，烏魯木齊 830052；2新疆農業(yè)大學科學與技術學院，烏魯木齊 830091；3中國農業(yè)科學院作物科學研究所/國家小麥改良中心，北京 100081）

【目的】克隆小麥阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基轉移酶（arabinoxylan feruloyl transferase，AFT）基因，開發(fā)與FAX含量緊密連鎖的功能標記，提高對FAX含量預測的準確性，為小麥加工品質的改良提供依據(jù)?！痉椒ā繎肍R846233為探針，通過同源克隆的方法獲得小麥FAX含量基因gDNA全序列，使用DNAMAN軟件比較高、低FAX含量品種間的序列差異性；基于序列差異使用Primer5.0軟件設計特異性引物，開發(fā)與FAX含量緊密連鎖的功能標記并利用一套中國春缺體-四體系和3AL、3AS雙端體系進行染色體物理定位；同時結合PCR驗證的方法，利用253份來自于中國主要冬麥區(qū)的小麥品種（系）對功能標記的實用性進行驗證，采用IBM SPSS statistics 19.0軟件進行FAX含量與基因型間的相關性分析等數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析?！窘Y果】2對特異性引物B1、B2最終擴增出長度分別為800 bp及710 bp的片段，B1和B2擴增的PCR片段有80 bp重疊，將片段拼接得到位于3A染色體上AFT基因。序列由1 429個堿基對組成，得到等位變異和，2個等位變異都擁有一個1 266 bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF），都具有2個外顯子和1個內含子，內含子符合典型GT-AG結構，等位變異序列之間相似度為98.08%，具有24個單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點和3個插入缺失（insertion-deletion，InDel）InDel位點，可編碼421個氨基酸殘基，預測分子量為45.2 kD。基于107 bp SNP處開發(fā)了2個互補顯性標記AFTA2和AFTB2。AFTA2在材料中能擴增出692 bp片段，與高FAX含量相關，在具有等位變異的材料中未能擴增出片段。AFTB2則只能在等位變異類型的材料中擴增出438 bp片段，并與低FAX含量相關，在等位變異類型的材料中未能擴增出片段。同時利用一套中國春缺體-四體系和雙端體材料將AFTA2和AFTB2定位在小麥3AL染色體。用功能標記AFTA2和AFTB2檢測253份中國冬小麥材料，結果表明，不同基因型的FAX含量差異達到顯著水平（＜0.05）。從不同麥區(qū)來看表現(xiàn)各有不同，其中在北部冬麥區(qū)不同基因型的FAX含量在北部冬麥區(qū)材料間差異不顯著；而在黃淮麥區(qū)，含有的品種FAX含量顯著高于含有的品種（＜0.05）。等位變異分布頻率表明，是與高FAX含量相關優(yōu)異等位變異，且北部冬麥區(qū)的頻率（71.3%）顯著高于黃淮冬麥區(qū)（60.2%）。【結論】基于序列成功開發(fā)1對顯性互補標記AFTA2/AFTB2并定位于3AL染色體，標記與FAX含量相關可用于FAX含量的遺傳改良。

普通小麥；阿魏酰阿拉伯木聚糖；基因克??；功能標記開發(fā)

0 引言

【研究意義】隨著人們生活水平的提高，小麥品質已是影響產業(yè)競爭力的重要因素，小麥品質改良已成為小麥育種和生產的重要目標[1-4]。阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）是小麥中一種非淀粉多聚糖，通過阿魏酰阿拉伯木聚糖（feruloyl arabinoxylan，F(xiàn)AX）結構中的阿魏?；趸宦?lián)形成凝膠網絡，進而對小麥面團流變學特性及其加工品質產生影響[5]。AX不僅能增加面團的吸水能力和黏度，提高面筋強度[6]，而且還成為倍受關注的膳食纖維重要組分[7]，具有降低血清膽固醇、調節(jié)血糖水平、抗氧化等重要生理功能[8]，因而與小麥的營養(yǎng)品質與健康品質密切相關。FAX由阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基轉移酶（arabinoxylan feruloyl transferase，AFT）催化合成，其含量高低是決定小麥AX結構和性質的關鍵因素[9]。功能標記是依據(jù)目標基因多態(tài)性序列引起表型性狀差異開發(fā)出來的一種新類型標記，可以多種遺傳背景下確定目標等位基因的存在[10-11]。因此，探究AFT基因的特性并開發(fā)相應的功能標記，有助于提高對表型預測的準確性，提高分子標記輔助育種的效率，對于改良小麥品質和分子輔助育種具有重要意義。【前人研究進展】FAX含量是由多基因控制的復雜數(shù)量性狀，受環(huán)境影響大，但其主要受遺傳因素影響[12]，直接對多基因控制的復雜數(shù)量性狀進行選擇難度較大，利用分子標記聚合相關基因是進行遺傳改良的重要途徑。Martinant等[13]以面粉提取物黏度等參數(shù)指標發(fā)現(xiàn)遺傳相關性，并在Synthetic與Opata雜交小麥的1BL染色體上發(fā)現(xiàn)了相對黏度和Ara/Xyl比值有關的數(shù)量特性基因位點。Rao等[14-15]研究表明在不同植物或同種植物不同品種間FAX含量的差異很大。ORDAZ-ORTIZ等[16]也發(fā)現(xiàn)小麥品種間同時存在AX數(shù)量和結構的差異，而且水溶性阿拉伯木聚糖（water-extractable arabinoxylan，WEAX）與水不溶性阿拉伯木聚糖（water-unextractable ara-binoxylan，WUAX）的結構變化趨勢（Ara/Xyl）基本一致。木糖（Xyl）和阿拉伯糖（Ara）聚合成戊聚糖（Pentosans），通常稱之為阿拉伯木聚糖[17]。張岐軍等[17]以17份軟質小麥品種進行了兩年多點試驗，并提出在軟質小麥育種中應選取戊聚糖含量低的品種。在總戊聚糖含量未顯著差異的前提下，軟麥的水溶性戊聚糖含量顯著低于硬麥[18]。植物中特有的BAHD酰基轉移酶家族，是次生代謝產物?；囊活愋揎椀鞍?，對多種酰基化生物合成有重要關系[19]。AFT基因是BAHD基因家族成員之一，且阿拉伯木聚糖阿魏酸?；D移酶是影響FAX含量的關鍵酶[20]。Mitchell等[20]發(fā)現(xiàn)AFT基因由酰基轉移酶基因家族成員所編碼。如今，水稻中AFT基因已被定位于第1染色體組[21]。根據(jù)禾本科植物基因共線性原理，結合水稻中AFT基因的定位結果，Tanaka等[22]和MATSUMOTO等[23]推測小麥AFT基因位于第3同源染色體組。Li等[24]利用PH82-2/內鄉(xiāng)的240個重組自交系群體（recombinant inbred lines，RIL）測定小麥籽粒中總AX含量（TOT-AX），共使用195個SSR和STS標記構建遺傳圖譜并檢測數(shù)量性狀基因座，在1A、1B、2B、3B、5A、5B、6B、7A和7B染色體上鑒定了9個加性QTL，解釋了3.8%—15.2%的表型變異。呂文娟等[25]利用周麥16/藁城8901的176個RIL群體的表型數(shù)據(jù)同時使用90 K的iSelect基因芯片針對FAX含量作了全基因組連鎖分析，在RIL群體中發(fā)現(xiàn)了小麥FAX含量的5個主效QTL位點，分布在2AS、2BS、2DL、3AS和6AS染色體上，單個QTL可解釋的6.3%—18.2%的表型變異，其中在3A染色體上發(fā)現(xiàn)的位點可解釋最大的表型變異。【本研究切入點】目前，國內外對FAX性能關注度較高[26-27]，而對FAX含量的遺傳特性報道較少。呂文娟等[25]通過全基因組關聯(lián)分析，利用距最近的SNP標記對200份冬小麥品種（系）進行檢測，驗證了小麥第3同源染色體組上存在調控FAX含量的主效基因。但這些SNP標記與基因之間尚有一定距離（1.3 cM），為了更準確地鑒定小麥品種FAX含量的基因型，有必要對主效位點基因進行克隆，并根據(jù)該基因位點不同等位基因的序列開發(fā)共分離的功能標記，進一步提高分子標記選擇的準確性和育種效率?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過同源克隆獲得小麥FAX含量基因gDNA全序列，且根據(jù)高、低FAX含量品種間的序列差異設計特異性引物來挖掘與FAX含量緊密連鎖的功能標記，同時利用253份來自于中國主要冬麥區(qū)的小麥品種（系）對功能標記的實用性進行驗證，明確等位基因在冬麥區(qū)的分布。

1 材料與方法

1.1 供試材料

中國春缺體-四體系（Chinese Spring Nullisomic- tetrasomic）和雙端體系3AL、3AS材料用于功能標記的染色體物理定位，由中國農業(yè)科學院作物科學研究所小麥品質課題組贈予。藁城8901/周麥16（與呂文娟等[25]為同一RIL群體176個株系的親本）用于基因克隆，于2013—2014年度和2014—2015年度種植于河南安陽。北部冬麥區(qū)和黃淮麥區(qū)的253份國內外冬麥品種（系）用于功能標記開發(fā)驗證。上述材料基本反映了中國主要冬麥區(qū)小麥育種和生產現(xiàn)狀。87份北部小麥品種（系）分別于2012—2013年度和2013—2014年度種植于北京和石家莊，166份黃淮麥區(qū)小麥品種（系）分別于2012—2013年度和2013—2014年度種植于河南安陽和安徽濉溪。以上全部材料隨機區(qū)組設計，3次重復3行區(qū)，行長2 m，行距25 cM，田間管理按照當?shù)爻Ｒ?guī)栽培管理方式，小麥田間長勢良好，正常收獲，無倒伏和穗發(fā)芽現(xiàn)象。

1.2 FAX含量測定

FAX含量使用722型分光光度計測定。試驗以空白溶液為對照，用草酸溶液作為提取液，測定345和375 nm雙波長下的吸光度值（A），最終依據(jù)朗伯比爾定律計算FAX的含量。具體檢測方法參考呂文娟等[25]方法并略作修改。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

253份冬小麥品種（系）表型數(shù)據(jù)[25]及FAX含量與基因型間的相關性分析等數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用IBM SPSS statistics 19.0軟件進行[28]。

1.4 TaBahd-A1的克隆策略

利用Primer 5.0軟件，應用普通小麥AFT基因的cDNA序列FR846233為探針對GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索。將得到的相似性高的cDNA序列比對，在序列的SNP和InDel基礎上，設計覆蓋編碼區(qū)的染色體特異性引物。同時，利用中國春缺體-四體系對所設計引物進行特異性定位，確保所克隆基因來源于3A染色體。取三粒小麥籽粒分別磨成粉末，采用SDS法提取小麥基因組DNA，詳細步驟參照李冰等[29]酚氯仿法，但取用量略作調整。以小麥籽粒提取的DNA為模版，通過B1、B2引物PCR擴增AFT基因的gDNA全序列。

PCR反應條件為94℃ 5 min；94℃ 50 s，63℃/ 62℃ 50 s；72℃ 1 min；35/30個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保溫。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液體系電泳后，進行溴化乙錠染色。采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行目標條帶的回收純化，再選用平末端連接試劑盒進行連接轉化，連接載體為Trins-T1的大腸桿菌感受態(tài)細胞，以上試劑均由北京全式金生物技術有限公司（http://www.transgen.com. cn）提供，最后將篩選的陽性單克隆菌液送測序，每個PCR反應最少3次。以上引物合成及測序由上海生工生物技術有限責任公司（http://www.sangon.com/）完成。

1.5 TaBahd-A1的功能標記開發(fā)

通過DNAMAN 5.0軟件比較不同冬麥區(qū)高、低FAX含量品種間的序列差異性，設計多對引物用來篩選不同品種間的多態(tài)性，以期開發(fā)功能標記。依據(jù)SNP及InDel設計的引物，應使擴增產物大小適宜便于觀察，從而能夠較好地在瓊脂糖膠上進行電泳結果分析。PCR擴增條件參照1.4，退火溫度及循環(huán)數(shù)略作調整。利用一套中國春缺體-四體系和雙端體系材料對標記進行染色體定位。

2 結果

2.1 TaBahd-A1的克隆

以普通小麥籽粒中的cDNA序列（GenBank登錄號FR846233）為探針，在GenBank/ EMBL/DDBJ中BLAST小麥表達序列標簽（Expressed sequence taq，EST）數(shù)據(jù)庫，檢索出3個序列：普通小麥mRNA序列（GenBank登錄號AK336201）、大麥mRNA序列（GenBank登錄號AK362895）和水稻mRNA（GenBank登錄號AK287601）。cDNA序列FR846233是小麥全部編碼序列，與上述3個序列分別具有99%、95%和83%的序列相似性。本研究基于上述4個序列的SNP和InDel，設計了2個染色體特異性引物B1和B2（表1），并通過中國春缺體-四體系將B1和B2擴增產物定位于3A染色體上（圖1）。B1和B2能分別擴增出長度為800和710 bp的DNA片段，兩者有80 bp的重疊區(qū)，重疊區(qū)序列相似性達100%，最后將擴增序列進行拼接得到位置在3A染色體上的的gDNA全序列。

2.2 TaBahd-A1的結構及序列分析

的gDNA序列由1 429個堿基對組成，具有一個1 266 bp完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF），同F(xiàn)R846233具有100%的序列相似性，包含2個外顯子和1個內含子，內含子的剪接位點結構符合典型的GT-AG型（圖2）。能編碼421個氨基酸殘基，預測分子量為45.2 kD。利用DNAMAN5.0軟件對RIL群體176個株系的2個親本藁城8901和周麥16的序列進行比對分析，獲得2個等位變異序列，分別命名為和。其中與等位變異序列之間相似度為98.08%，共有24處SNP位點，而且內含子區(qū)有3處插入缺失（圖2）。

表1 克隆小麥TaBahd-A1及根據(jù)TaBahd-A1不同等位變異開發(fā)功能標記的引物序列

a和b代表不同堿基長度，a代表聚合連鎖反應產物大小，b代表等位基因全長大小

aandbrepresent different base lengths,arepresents the size of the polymerization chain reaction products, andbrepresents the full length of theallele

M：DL2000；1：N1A-T1B；2：N1B-T1D；3：N1D-T1A；4：N2A-T2D；5：N2B-T2A；6：N2D-T2B；7：N3A-T3B；8：N3B-T3D；9：N3D-T3A；10：N4A-T4B；11：LDN4D(4B)；12：DT4BS；13：N5A-T5B；14：N5B-T5D；15：N5D-T5A；16：N6A-T6B；17：N6B-T6D；18：N6D-T6A；19：N7A-T7B；20：N7B-T7D；21：N7D-T7A

2.3 TaBahd-A1的功能標記開發(fā)

基于的等位變異與在107 bp位置的1個SNP位點，開發(fā)1對顯性互補的功能標記AFTA2與AFTB2（表1）。AFTA2在具有的材料中能擴增出692 bp片段，而在具有的材料中不能擴增出片段；AFTB2在具有的材料中能擴增出438 bp片段，而在具有的材料中不能擴增出片段（圖3）。利用中國春缺體-四體系和3AL、3AS雙端體系對標記AFTA2/AFTB2進行染色體物理定位。表明用AFTB2擴增缺體-四體系時，僅N3A-T3B和DT-3AS沒有擴增出目的DNA片段，而DT-3AL等其余泳道均擴增出438 bp的DNA片段（圖4）。因此，推斷所開發(fā)的標記及其對應的位于小麥3AL染色體上。

2.4 TaBahd-A1的功能標記的驗證

利用253份小麥品種（系）對所開發(fā)功能標記進行驗證，表明黃淮麥區(qū)、北部冬麥區(qū)和全部材料中具有等位變異類型品種（系）的平均FAX含量分別為4.419、4.625和4.498×10-5mol·L-1；而具有等位變異類型品種（系）的平均FAX含量分別為4.570、4.384和4.435×10-5mol·L-1。從全部材料總體上和黃淮麥區(qū)來看，具有等位變異類型的材料FAX含量均顯著高于具有等位變異類型的材料（＜0.05）；但在北部麥區(qū)，具有和等位變異類型品種（系）的FAX含量間差異不顯著。因此，不同等位變異與FAX含量顯著相關，AFTA2/AFTB2能有效應用于分子標記輔助選擇育種實踐，以提高對FAX含量表型預測的準確性（表2）。

2.5 TaBahd-A1等位基因的分布

通過對等位變異在北部麥區(qū)（BV）和黃淮麥區(qū)（HV）的頻率分布進行統(tǒng)計分析。是高FAX含量優(yōu)異等位變異，在253份冬小麥品種（系）中，162份材料中擴增出692 bp片段，表明含有與高FAX含量相關的占比64%；在91份材料中擴增出438 bp片段，表明含有與低FAX含量相關的占比36.0%（表3）。在北部冬麥區(qū)的87份品種（系）中，62份（71.3%）材料具有等位變異基因，25份（28.7%）材料具有等位變異基因。而黃淮冬麥區(qū)166份品種（系）中，100份（60.2%）材料具有等位變異基因（表3）。高FAX含量可使AX產生更廣泛地交聯(lián)，可提高小麥的面筋強度和改善小麥的加工品質。總體來看，中國小麥材料FAX含量具有較大的選擇潛力，尤其是北部冬麥區(qū)品種高FAX含量頻率較高，通過選擇等位變異從而對提升面制品品質，提高人們的消費質量具有重要意義。

陰影表示SNP和InDel；下劃線表示內含子；方框表示功能標記AFTA2和AFTB2的上游引物的反向互補序列、下游引物序列以及起始密碼子

M：D2000；1：PALPICH（4.18）；2：Tx03A0148（4.30）；3：NSA09-3645（4.78）；4 F498U（4.34）；5：中麥175（4.41）；6：Genio（4.10）；7：Manital（4.78）；8：晉麥67（4.79）；9：洋小麥（4.83）；10：Kitanokaori（4.55）；11：Aca801（4.55）；12：小堰54（4.60）。括號中數(shù)字代表FAX含量，單位為10-5 mol·L-1

M：DL2000；1：N1A-T1B；2：N1B-T1D；3：N1D-T1A；4：N2A-T2D；5：N2B-T2A；6：N2D-T2B；7：N3A-T3B；8：N3B-T3D；9：N3D-T3A；10：N4A-T4B；11：LDN4D (4B)；12：DT4BS；13：N5A-T5B；14：N5B-T5D；15：N5D-T5A；16：N6A-T6B；17：N6B-T6D；18：N6D-T6A；19：N7A-T7B；20：N7B-T7D；21：N7D-T7A；22：中國春CS；23：DT-3AS；24：DT-3AL

表2 利用標記AFTA2和AFTB2檢測253份冬小麥材料的統(tǒng)計分析

不同字母表示兩組間的均值差異顯著（＜0.05）

Mean behind the different letters represent the average difference between two groups is significant (＜0.05)

表3 等位基因TaBahd-A1a和TaBahd-A1b在不同麥區(qū)的分布頻率

3 討論

3.1 小麥TaBahd-A1的克隆和染色體定位

普通小麥為異源六倍體，不僅基因組龐大復雜，而且重復序列多，不利于直接進行基因的圖位克隆操作[10]。小麥大多基因在A、B、D基因組上均有分布[3]，有些基因甚至在同一染色體上還有多拷貝[30]，這些都增加了基因克隆和功能分析的難度，所以對基因染色體的定位和序列所在連鎖群的驗證是基因克隆獲得成功的必要條件。本研究采用同源克隆的方法，以cDNA全序列（FR846233）為探針對GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索，將得到的相似性高的cDNA序列進行序列分析和歸類?；谝陨闲蛄械腟NP和InDel，設計了用于克隆的2對引物B1和B2，并用中國春缺體-四體系對2對引物染色體的特異性進行了驗證，最終將其定位于3A染色體上。B1和B2分別擴增出的兩DNA片段有80個bp的重疊區(qū)，且重疊區(qū)序列相似性達100%，將定位于同一3A染色體上兩序列拼接起來，從而獲得的全序列。同樣，李冰等[29]將在二倍體、四倍體、六倍體進行比對區(qū)分最終將標記定位在5A染色體上。李亞青等[31]通過使用中國春缺體-四體系，最終利用Southern雜交將基因定位在第一同源群。

遺傳圖譜依據(jù)分子標記所建立，其對目標性狀進行QTL分析是基因遺傳定位的高效方法[3]。然而分子標記在群體偏小特別研究數(shù)量性狀時會產生偏差[32]，故用中國春缺體-四體系對基因進行物理定位是必要的。本研究通過用AFTA2與AFTB2擴增中國春缺體-四體系和3AS、3AL雙端體系，最終成功將所開發(fā)標記定位于3AL染色體上。利用同樣方法，Hessler等[32]將硬粒小麥的LOX基因定位于4BS染色體上。Sun等[33]開發(fā)了位于2A染色體上PPO基因的功能標記PPO18。而呂文娟等[25]通過全基因組連鎖分析在5個染色體上均發(fā)現(xiàn)了小麥FAX含量主效位點，其中3AS上的位點可解釋最大的表型變異（18.2%），該結果與本研究中獲得的被物理定位于3AL的不一致，表明3A染色體至少存在1個與FAX含量相關基因。通過全基因組連鎖分析發(fā)現(xiàn)位點是基于RIL群體，構建群體的親本間遺傳背景多樣性的局限性影響很大，可能會對其他重要位點有所遺漏[25]。同時Carrera等[34]指出，一些與QTL連鎖的分子標記并非功能標記，不能準確預測基因型。下一步我們的工作將是對位點進行精細定位，并利用合適的遺傳群體對FAX含量進行QTL研究，進一步發(fā)掘與FAX含量相關的主效QTL，并開發(fā)能應用于育種實踐的分子標記，有助于通過分子標記輔助選擇加速FAX含量的遺傳改良。

3.2 TaBahd-A1與其他作物BAHD基因的比較

水稻中位于第1染色體組的BAHD基因全長gDNA序列（GenBank登錄號AK287601）已被克隆[35]。BAHD基因序列的聚類分析表明，水稻BAHD基因（AK287601）與小麥分別具有1 339和1 266 bp的開放閱讀框。兩者在gDNA水平的相似性為79.0%，在cDNA的相似性為83.6%，在推導出的氨基酸水平上的相似性為83.6%。國外研究發(fā)現(xiàn)BAHD家族大多數(shù)功能特征酶都有2個保守的功能域HXXXD和DFGWG，中HXXXD域（His159至Asp163）位于中心酶催化合成附近，該功能特征酶已被證明是乙酰轉移酶催化機制的重要組分[36]。DFGWG相關機制尚未明確，可能其位置遠離中心區(qū)僅起到結構作用[37]。BAHD基因位于小麥3A染色體，而在水稻中位于第1染色體。雖然它們具有不同的序列長度和序列變異，但都包含2個外顯子和1個內含子?？墒切←淏AHD基因（和）和水稻BAHD基因（AK287601）第1外顯子和第2外顯子的長度差別較大[35-37]。在2種小麥BAHD基因中，外顯子大小有很高的保守性，而在不同的谷物中，外顯子大小的差異比較大。以上結果表明，在同一種谷類作物特別是普通小麥中，與其他谷物相比，BAHD基因的外顯子長度更保守[38]。

3.3 TaBahd-A1的功能標記的實用性評價

功能標記可以準確區(qū)分與表型相關的不同等位變異類型，從而在小麥育種中能顯著提高分子標記選擇的準確性和選擇的高效性。小麥品質方面功能基因的挖掘和轉化利用在近幾年取得重要進展，并獲得了多個與小麥品質相關的功能基因[1-2]。高華利等[11]表明62個相關小麥籽粒加工品質的等位基因已被克隆，共有63個功能標記被驗證。由于FAX含量遺傳特性研究報道較少，而與小麥AFT基因共分離的功能標記也尚未見報道。本研究中，基于開發(fā)功能標記，能有效用于FAX含量高低檢測。中國小麥材料以與高FAX含量相關的優(yōu)異等位變異類型為主（64%）。其中，北部冬麥區(qū)品種（系）高FAX含量相關的等位變異類型分布頻率高于黃淮麥區(qū)（71.3% VS 60.2%），這可能由于北方地區(qū)的傳統(tǒng)食品諸如饅頭、面條等對小麥面筋、面團流變學特性等都有較高要求[5]。特別是自20世紀80年代后，中國開始對小麥品質研究逐步加強，為了提升面制品品質，經過長期有針對性的對高強筋、面團性好的小麥品種（系）進行選擇，使得具有高FAX含量相關的等位變異類型的材料得以保留和積累。AX雖然在面粉中含量較少（4.8%—7.0%），卻是小麥中膳食纖維的重要組分[5]，已成為除淀粉、多糖外，近幾年備受關注的小麥組分。雖然不同等位變異相關的FAX含量較為相近，但不同品種間FAX含量的差異即可通過其生理生化作用直接對加工品質產生影響，與此同時亦能間接的通過影響面筋含量等其他品質性狀，從而造成材料間的加工品質差異顯著。類似的現(xiàn)象在小麥其他小麥品質遺傳改良的研究中[39]。Tremmel等[39]利用中國小麥品種豫麥34號和3個中歐品種對小麥籽粒硬度、面筋指數(shù)等參數(shù)進行了研究，結果表明，當WE-AX含量增加0.5%時，面粉的含量、面團流變學特性得到了改善，總AX含量提高1%時，千粒重量、蛋白質含量、面筋含量、面粉的水分和吸水性也會相應增加。因此，不同品種間FAX含量差異不大，但對小麥最終的加工品質而言是較為敏感成分，用相關標記進行FAX含量的遺傳改良具有一定的研究意義。FAX含量由多基因控制，Li等[24]和呂文娟等[25]均在不同染色體發(fā)現(xiàn)不同QTL位點，同時單核苷酸位點微效累積貢獻率和大量基因的影響也會對表型產生增強或抵消作用[40]。本研究中功能標記AFTA2和AFTB2與高、低FAX含量的2組材料密切相關。然而，個別基因型與FAX含量不相符，含有相同等位變異的品種間FAX含量也存在差異，并且型品種的FAX含量并非總是高于型品種，反之亦然。同樣，Geng等[3]通過LOX基因等位變異一處SNP位點開發(fā)了1對顯性互補標記LOX16和LOX18，表明的LOX活性并非總是高于型等位變異品種，印證小麥LOX活性受多基因控制。上述差異是由位于小麥其他染色體或同一染色體不同位點上的其他控制小麥FAX含量的QTL造成的[41-42]，同時也印證了小麥FAX含量受多基因控制的結論。今后將進一步針對重要主效位點進行精細定位或者基于其他等位基因開發(fā)功能標記，通過多個組合標記檢測來提高選擇的效率和準確性。

4 結論

基于序列成功開發(fā)一對功能標記AFTA2/AFTB2并定位于3AL染色體，表明3A染色體可能至少存在1個與FAX含量相關基因，該標記能準確鑒定小麥品種中與FAX含量高低相關的和基因型，且北部冬麥區(qū)品種（系）高FAX含量相關的等位變異類型分布頻率高于黃淮麥區(qū)，個別基因型與FAX含量不相符，含有相同等位變異的品種間FAX含量也存在差異，印證了小麥FAX含量受多基因控制。

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（責任編輯 李莉）

Arabinoxylan feruloyl transferase gene cloning and development of functional markers in common wheat

ZHAN ShuaiShuai1, BAI Lu2, XIE Lei1, XIA XianChun3, REN Yi1, Lü WenJuan1, QU YanYing1, GENG HongWei1

(1College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University/Laboratory of Agricultural Biological Technology, Urumqi 830052;2College of science and technology, xinjiang agricultural university, urumqi 830091;3Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Wheat Improvement Center, Beijing 100081)

【Objective】 The arabinoxylan feruloyl transferase (AFT) gene was cloned from wheat, and the functional markers linked to the content of FAX were developed to improve the accuracy of predicting the content of FAX , in order to provide the basis for the improvement of wheat processing quality. 【Method】 The complete gDNA sequence of wheat FAX gene was obtained by homologous cloning method，using FR846233 as a probe. The sequence differences between high and low FAX content varieties were compared by the DNAMAN software; based on sequence difference, specific primers were designed with Primer5.0 software to develop functional markers closely linked to FAX content and a set of Chinese spring Nullisomic-tetrasomic lines and ditelosomic line 3AS, and 3AL were used for chromosome physical mapping; and the practicability of functional markers were verified by using 253 wheat varieties (lines) from the main winter wheat regions in China, combined with the method of PCR verification. IBM SPSS statistics 19.0 software was used to analyze the correlation between FAX content and genotypes. 【Result】Two pairs of specific primers B1 and B2 finally amplified fragments of 800 bp and 710 bp, respectively. And 80 bp overlaps of PCR fragments amplified by B1 and B2 were spliced to obtain the AFT gene that is located on chromosome 3A. Thesequence is consists of 1 429 base pairs and allelic variantsandare obtained. The two allelic variants possess a 1 266 bp open reading frame, two exons and one intron. The introns conformed to the typical GT-AG structure. The similarity between the alleles was 98.08%, with 24 SNPs and 3 InDels, which could encode 421 amino acid residues and the predicted molecular weight was 45.2 kDa. Two complementary dominant markers AFTA2 and AFTB2 were developed based on the 107 bp SNP. AFTA2 was able to amplify a 692 bp fragment in thematerial, which was associated with a high FAX content, but not in the material withallelic variation. AFTB2 could only amplify a 438 bp fragment intype material and correlate with low FAX content, but not intype material, and AFTA2 and AFTB2 were located in 3AL chromosome of wheat by a set of Chinese spring Nullisomic-tetrasomic lines. Using the functional markers AFTA2 and AFTB2 to detect 253 Chinese winter wheat materials, the results showed that the difference in FAX content of different genotypes reached a significant level (＜0.05), and there was no significant difference in FAX content in Northern China Plain Winter Wheat Region; but in the Huang-Huai River Valley Winter Wheat Region, The FAX content of the-containing variety was significantly higher than that of the- containing variety (＜0.05). Therefore, the complementary dominant markers AFTA2 and AFTB2 are related to FAX content and can be effectively used for genetic improvement of FAX content. The frequency ofallele variation indicates thatis an excellent allelic variant associated with high FAX content, and the frequency ofin the Northern China Plain Winter Wheat Region (71.3%) is significantly higher than that in the Huang-Huai River Valley Winter Wheat Region (60.2%). 【Conclusion】 The results suggested that these two STS markers are closely related to FAX content related gene and could be used for the improvement of wheat processing quality for wheat-based products.

common wheat; feruloyl arabinoxylan; gene cloning; functional marker development

2018-04-21；

2018-05-25

國家自然科學基金（31771786）、自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程（QN2016JQ0025）

戰(zhàn)帥帥，Tel：17690762406；E-mail：1269047935@qq.com。 通信作者耿洪偉，Tel：13579873801；E-mail：hw-geng@163.com