張劍碩，馬金姣，張彤，陳悅，魏健，張柳，史佳楠，徐珊，燕高偉， 杜鐵民，竇世娟，李莉云，劉麗娟，劉國振

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水稻蛋白質(zhì)樣品資源庫RiceS-A300的建立與應(yīng)用

張劍碩，馬金姣，張彤，陳悅，魏健，張柳，史佳楠，徐珊，燕高偉， 杜鐵民，竇世娟，李莉云，劉麗娟，劉國振

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001）

【目的】建立水稻幼苗脅迫處理的蛋白質(zhì)樣品資源庫RiceS-A300，應(yīng)用RiceS-A300調(diào)查內(nèi)參蛋白質(zhì)HSP82的表達(dá)特征?！痉椒ā烤綯P309種子在30℃條件下浸泡3 d露白，土培用蛭石土（土壤與蛭石1﹕1）培養(yǎng)，30℃、光周期L12 h/D12 h培養(yǎng)5 d，進(jìn)行冷（4℃）、熱（44℃、48℃）、淹和恒光、恒暗處理，水培播種在紗網(wǎng)上，以30℃、光周期L12 h/D12 h培養(yǎng)5 d，進(jìn)行PEG 6000（20%）和NaCl（0.2 mol·L-1）處理。以30℃、光周期L12 h/D12 h非脅迫處理為對(duì)照。在不同時(shí)間點(diǎn)觀察、拍照并取材，測(cè)定各種處理?xiàng)l件下的株高和鮮重，提取總蛋白質(zhì)建立水稻幼苗脅迫處理的蛋白質(zhì)樣品資源庫，SDS-PAGE分離總蛋白質(zhì)后進(jìn)行考染，以此評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)質(zhì)量。通過免疫印跡（WB）技術(shù)分析樣品中內(nèi)參蛋白質(zhì)HSP82的表達(dá)特征?！窘Y(jié)果】調(diào)查各種脅迫處理過程中9個(gè)時(shí)間點(diǎn)的幼苗表型、株高、鮮重和總蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)：冷（4℃）、熱（44℃、48℃）溫度脅迫在2 d內(nèi)即表現(xiàn)出對(duì)株高的抑制作用，淹脅迫能促進(jìn)株高伸長，恒暗和恒光處理均能抑制株高，恒暗處理使幼苗變黃，PEG與鹽脅迫也能明顯抑制株高的伸長，且鹽脅迫在5 d后可見明顯葉尖干枯。對(duì)鮮重的調(diào)查結(jié)果表明，冷（4℃）、熱（44℃、48℃）溫度脅迫、PEG脅迫和鹽脅迫均會(huì)降低幼苗鮮重，淹脅迫對(duì)鮮重的影響較小，恒暗處理會(huì)降低鮮重而恒光處理對(duì)鮮重影響不明顯。3種溫度脅迫都使總蛋白質(zhì)含量提高，恒暗脅迫則降低總蛋白質(zhì)含量，其他脅迫對(duì)總蛋白質(zhì)含量影響不大。累計(jì)收集近300份蛋白質(zhì)樣品，建立了水稻蛋白質(zhì)樣品資源庫（RiceS-A300），每份樣品體積為2 ml，可供200次WB分析，由于試驗(yàn)所采用的條件比較規(guī)范且容易控制，可根據(jù)需要重復(fù)擴(kuò)大樣品的規(guī)模，預(yù)期不同的實(shí)驗(yàn)室采用相同的條件獲得的蛋白質(zhì)樣品也能獲得可重復(fù)的試驗(yàn)結(jié)果，利用RiceS-A300調(diào)查HSP82蛋白質(zhì)的表達(dá)特征，顯示熱脅迫明顯提高了HSP82的表達(dá)，恒光、PEG和鹽脅迫也對(duì)HSP82的表達(dá)有一定影響，而淹脅迫和恒暗處理對(duì)HSP82的影響不大。對(duì)RiceS-A300資源庫的評(píng)價(jià)擴(kuò)展了HSP82內(nèi)參蛋白質(zhì)的用途。【結(jié)論】提出了蛋白質(zhì)樣品資源庫建設(shè)和評(píng)價(jià)的流程，建立了第一個(gè)版本的脅迫處理?xiàng)l件下的水稻幼苗蛋白質(zhì)樣品資源庫（RiceS-A300）；在此基礎(chǔ)上，通過WB調(diào)查了HSP82蛋白質(zhì)的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)其在熱脅迫下有特異誘導(dǎo)表達(dá)。

水稻；蛋白質(zhì)樣品資源庫；內(nèi)參蛋白質(zhì)；免疫印跡；熱激蛋白

0 引言

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是基礎(chǔ)研究的模式生物[1]。脅迫可分為生物脅迫和非生物脅迫，常見的非生物脅迫包括冷、熱、淹、光照、旱、鹽等，水稻在脅迫條件下的生長發(fā)育和產(chǎn)量都會(huì)受到影響，了解水稻脅迫反應(yīng)應(yīng)答機(jī)理具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】水稻是最早完成基因組測(cè)序的作物，中國科學(xué)家最早完成了超級(jí)雜交稻父本9311的基因組測(cè)序[2]，在水稻基因組以及多種重要植物的基因組測(cè)序工作中發(fā)揮了引領(lǐng)作用。目前，在建立水稻全基因組基因芯片平臺(tái)[3]及二代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)上，已經(jīng)積累了豐富的不同時(shí)空條件下的轉(zhuǎn)錄組信息[4-6]。在水稻基礎(chǔ)研究的不同階段，支撐性平臺(tái)技術(shù)都發(fā)揮了重要的作用，如20世紀(jì)末的分子標(biāo)記技術(shù)、遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)、基因組文庫和cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)、全長cDNA文庫，以及突變體庫、基因編輯技術(shù)等[7]，正是在這些平臺(tái)技術(shù)的支持下，水稻基礎(chǔ)研究得以飛速發(fā)展，為解析抗病、高產(chǎn)、光合、株型等機(jī)理做出了重要貢獻(xiàn)[8]。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的功能執(zhí)行分子，是基因功能的主要體現(xiàn)者，了解每個(gè)蛋白質(zhì)的狀態(tài)是生物學(xué)家今后面臨的挑戰(zhàn)。借助高靈敏度的質(zhì)譜技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)可以從人的多個(gè)組織樣品中累積鑒定到17 000個(gè)以上的蛋白質(zhì)[9]。為了特異性地檢測(cè)每個(gè)蛋白質(zhì)，瑞典科學(xué)家Uhlén實(shí)驗(yàn)室制備了3萬多個(gè)針對(duì)人的蛋白質(zhì)的抗體資源庫[10]?？梢哉f，質(zhì)譜和抗體是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的二大利器[11-12]。在水稻中，提出了基于抗體的蛋白質(zhì)組學(xué)策略，目前已經(jīng)制備了2 000多個(gè)水稻蛋白質(zhì)特異的抗體[13]。就像在人的蛋白質(zhì)研究中一樣，抗體也是水稻基礎(chǔ)研究的重要資源，可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、以及蛋白質(zhì)的修飾、降解等。與DNA的分析不同，RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)具有組織、時(shí)空特異性，樣品的穩(wěn)定性較低，所以對(duì)樣品的要求更高。只有可靠的樣品，試驗(yàn)結(jié)果才有意義。在人的組織病理研究中，樣品資源庫是專門的課題，如人的前列腺癌樣品資源庫[14]，研究兒童發(fā)熱與近視所建立的UK biobank[15]，研究人類衰老所建立的RPGEH樣品庫[16]，以及鼻咽癌資源庫[17]等。2017年，美國及多國科學(xué)家聯(lián)合啟動(dòng)的“人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃”（Human Cell Atlas，HCA），設(shè)想對(duì)人體中所有細(xì)胞進(jìn)行分類和測(cè)序，系統(tǒng)地描繪人體細(xì)胞圖譜，并通過這把鑰匙來加深對(duì)疾病診斷、監(jiān)測(cè)、治療的了解，可靠的樣品是保證項(xiàng)目質(zhì)量的前提[18]。Facebook創(chuàng)始人馬克·扎克伯格出資支持這項(xiàng)計(jì)劃，并將其與“人類基因組計(jì)劃”媲美[19]。2018年，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院郭國驥教授團(tuán)隊(duì)在Cell發(fā)表論文，報(bào)道了對(duì)小鼠不同生命階段的近50種器官組織的40余萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了系統(tǒng)性的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，構(gòu)建了首個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞圖譜[20]。在這項(xiàng)研究中，最關(guān)鍵的過程之一是如何分離單細(xì)胞并保證樣品的可靠性。另外，由于蛋白質(zhì)分子不能在體外進(jìn)行擴(kuò)增，所以蛋白質(zhì)分析中需要的樣品量要多于核酸分析。在植物研究中，樣品資源庫也將是一個(gè)重要的基礎(chǔ)平臺(tái)。免疫印跡（western blot，WB）是利用抗體的特異性對(duì)混合樣品中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，同酶聯(lián)免疫（ELISA）相比，WB具有更好的特異性，結(jié)果也更為直觀，WB是生物科學(xué)領(lǐng)域的基本檢測(cè)技術(shù)，有極為廣泛的應(yīng)用。近年來，在植物基因功能的研究中，引入或敲除特定基因后都需要借助WB檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而確認(rèn)引入或敲除的效果[21]。WB也可用于病原物的有無及豐度的檢測(cè)[22]。當(dāng)然，目前常規(guī)的WB分析還涉及比較繁瑣的人工操作的過程，但全自動(dòng)的WB儀器近年來已經(jīng)開始應(yīng)用[23]。非生物脅迫是影響水稻生長和產(chǎn)量的重要因素，冷、熱、旱、淹、鹽等都是常見的逆境，逆境脅迫會(huì)引起植物對(duì)逆境的反應(yīng)，包括一系列基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)與生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室（Molecular Biology & Bioinformatics Lab，MBB）曾利用WB技術(shù)調(diào)查了水稻類鈣調(diào)磷酸酶亞基B蛋白質(zhì)[24]、PP2Ac類磷酸酶蛋白質(zhì)[25]、水稻病程相關(guān)蛋白質(zhì)[26]、水稻核糖核酸酶T2蛋白質(zhì)[27]等在逆境脅迫下的表達(dá)，靶向性地揭示了這些蛋白質(zhì)在逆境脅迫條件下的表達(dá)特征。【本研究切入點(diǎn)】水稻是植物研究的模式生物，但系統(tǒng)性構(gòu)建蛋白質(zhì)樣品資源庫目前還屬空白，本研究結(jié)合水稻乃至植物研究的特點(diǎn)，開創(chuàng)性的提出蛋白質(zhì)樣品資源庫的概念，并提出了具體的建設(shè)流程和評(píng)價(jià)體系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以水稻幼苗為材料，進(jìn)行冷、熱、旱、鹽、淹、恒光、恒暗等脅迫處理，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，提取近300份蛋白質(zhì)樣品，對(duì)樣品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立脅迫條件下的水稻蛋白質(zhì)資源庫（RiceS-A300），并應(yīng)用這個(gè)資源庫檢測(cè)了MBB實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道的一個(gè)水稻內(nèi)參蛋白質(zhì)HSP82的表達(dá)特征。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

水稻品種：粳稻品種TP309。試驗(yàn)于2017年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)稻竹園及MBB實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 苗期培養(yǎng)

種子30℃浸泡3 d露白，土培用蛭石土（土壤與蛭石1﹕1），播種后30℃、光周期L12 h/D12 h培養(yǎng)5 d，進(jìn)行冷、熱、淹和恒光、恒暗處理。水培是將露白后的種子播放在紗網(wǎng)上，30℃、光周期L12 h/D12 h培養(yǎng)5 d，進(jìn)行旱和鹽處理。以30℃、光周期L12 h/D12 h的非脅迫處理材料為對(duì)照。

1.3 脅迫處理

冷：冷處理為4℃，取材時(shí)間點(diǎn)為0、2、4、8、12、18、24、36和48 h。熱：熱處理為44℃和48℃，取材時(shí)間點(diǎn)為0、2、4、8、12、18、24、36和48 h。淹：將水稻幼苗連同花盆浸沒于水中，葉尖離水面約30—40 cm，取材時(shí)間點(diǎn)為0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d和7 d。光照：恒光處理為24 h光照，恒暗處理為24 h黑暗，取材時(shí)間點(diǎn)為0、1、2、3、4、5、6、7和8 d，以L12 h/D12 h平行培養(yǎng)的材料為對(duì)照。旱：對(duì)水培培養(yǎng)5 d的水稻幼苗用PEG6000（20%）處理，取材時(shí)間點(diǎn)為0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d和7 d，以不加PEG的幼苗材料為對(duì)照。鹽：對(duì)水培培養(yǎng)5 d的水稻幼苗用NaCl（0.2 mol·L-1）處理，取材時(shí)間點(diǎn)為0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d和7 d，以不加NaCl的幼苗材料為對(duì)照。

1.4 株高和鮮重測(cè)量

用普通直尺測(cè)量地上部長度，每個(gè)樣品點(diǎn)測(cè)量5株以上，計(jì)算平均值和方差。鮮重測(cè)量：用千分之一天平稱量水稻整株幼苗的鮮重（包括地上部和地下部），每個(gè)樣品點(diǎn)測(cè)量5株以上，計(jì)算平均值和方差。

1.5 主要試劑

NaCl、PEG6000、甘氨酸和溴酚藍(lán)購自上海生工；Tris購自Sigma；甘油和NaF購自天津福晨；SDS、β-巰基乙醇、Arc、Bis和AP購自Biotopped；奶粉、HCl、吐溫20、TEMED、考馬斯亮藍(lán)R250、PMSF、EDTANa2和DTT購自索萊寶；甲醇購自保定天成；冰醋酸購自天津天大化工；HSP82抗體和羊抗鼠二抗購自華大蛋白；ECL化學(xué)發(fā)光液購自百智生物；PVDF膜購自Millipore；BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒購自寶生物。

1.6 主要儀器

低溫離心機(jī)（Thermo，D-37520）；電泳槽Mini PROTEAN Tetra cell（伯樂，552BR），電泳儀（伯樂，Power Pac Basic）、轉(zhuǎn)膜芯（伯樂）、pH計(jì)（Mettler-toledo，DELTA 320）；化學(xué)發(fā)光成像儀（賽智，MiniChemi 610）；天平（OHAUS，AR3130）；微量分光光度計(jì)（Eppendorf，）；光照培養(yǎng)箱（寧波賽福，PAX-350B）。

1.7 取材

地上部和地下部分別取材，統(tǒng)一按0.200 g裝入錫箔紙中，置于冰上，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 蛋白質(zhì)提取

取出凍存的水稻樣品，液氮冷凍后用研缽研磨，加入2 mL的蛋白質(zhì)提取液，具體步驟參見文獻(xiàn)[28]。

1.9 用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

將提取的蛋白質(zhì)用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，具體方法按試劑盒（TaKaRa BCA Protein Assay Kit）的說明書進(jìn)行。

1.10 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分離和考染

用10%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電壓160 V，電泳時(shí)間60 min，用考馬斯亮藍(lán)染色（染色液：甲醇45 mL、H2O 45 mL、冰乙酸10 mL和考馬斯亮藍(lán)R-250 0.25 g），脫色（脫色液：乙醇50 mL、冰乙酸100 mL和H2O 850 mL）后拍照。

1.11 WB分析

SDS-PAGE分離時(shí)，蛋白質(zhì)上樣體積為10 μL，電泳完成后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，按文獻(xiàn)[28]描述的過程進(jìn)行WB檢測(cè)，所用一抗為抗HSP82抗體[29]，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，檢測(cè)液為ECL，WB信號(hào)用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。為了對(duì)不同WB分析的結(jié)果進(jìn)行比較，以苗期5 d的幼苗（地上部+地下部）樣品作為共同參照（common reference，CR），點(diǎn)在每個(gè)WB的第一個(gè)泳道。

2 結(jié)果

2.1 不同脅迫處理對(duì)水稻幼苗表型的影響

在水稻幼苗脅迫的不同時(shí)間點(diǎn)拍照，以未經(jīng)脅迫處理的幼苗材料為對(duì)照（圖1）。從圖1-A可見，冷脅迫18 h，肉眼可見幼苗有失水、萎縮現(xiàn)象，處理1 d后，植株明顯矮于對(duì)照。從圖1-B可見，44℃脅迫18 h后，肉眼可見幼苗發(fā)黃、失水、萎縮，植株也明顯矮于對(duì)照。從圖1-C可見，48℃脅迫12 h后，肉眼即可見幼苗發(fā)黃、失水、萎縮，脅迫癥狀比植株44℃脅迫處理更重。從圖1-D可見，淹脅迫1—2 d后，肉眼即可見幼苗較對(duì)照更高，植株仍能維持直立，脅迫處理3 d后，植株倒伏，5 d后葉片組織明顯軟化。從圖1-E可見，恒暗脅迫1—2 d，即可肉眼看出葉片發(fā)黃，3 d以后葉片明顯整體變黃，7 d后葉片發(fā)生灰暗、萎蔫，植株較對(duì)照矮小。從圖1-F可見，恒光脅迫3 d內(nèi)表型變化不明顯，4 d后植株較對(duì)照矮小，葉片顏色更深。從圖1-G可見，PEG脅迫2 d后植株矮于對(duì)照，植株也更為纖細(xì)、瘦弱。從圖1-H可見，鹽脅迫處理后植株基本停止生長，至5 d時(shí)可見葉尖枯萎。從植株表型可見，在所設(shè)立的時(shí)間點(diǎn)范圍內(nèi)，不同脅迫對(duì)水稻幼苗均有肉眼可見的影響，表型的變化為保證取材的質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

2.2 不同脅迫處理對(duì)水稻幼苗株高的影響

株高是評(píng)價(jià)脅迫應(yīng)答反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)，調(diào)查不同處理在不同時(shí)間點(diǎn)的株高（圖2）。由圖2-A可見，在4℃冷脅迫條件下，水稻幼苗的株高伸長基本停止，二天內(nèi)即可與對(duì)照有顯著的區(qū)別。由圖2-B可見，44℃熱脅迫條件下，水稻幼苗的株高仍略有伸長，但在2 d內(nèi)與對(duì)照有顯著的區(qū)別。由圖2-C可見，在48℃熱脅迫條件下，水稻幼苗的株高生長停止，與對(duì)照有顯著的區(qū)別。由圖2-D可見，淹脅迫能促進(jìn)株高的伸長，脅迫7 d株高是對(duì)照的169%。由圖2-E可見，恒暗處理會(huì)抑制株高，在第4天株高達(dá)到峰值，之后株高持續(xù)下降。由圖2-F可見，恒光處理對(duì)株高也是抑制，但株高可以持續(xù)伸長，比較而言，恒光對(duì)水稻幼苗的影響小于恒暗。由圖2-G可見，PEG處理形成的干旱脅迫對(duì)株高有一定的抑制作用。由圖2-H可見，鹽脅迫對(duì)幼苗株高也有比較明顯的影響。

2.3 不同脅迫處理對(duì)水稻幼苗鮮重的影響

鮮重也是反映水稻植株生長狀況的重要指標(biāo)，調(diào)查不同處理在不同時(shí)間點(diǎn)的鮮重（圖3）。由圖3-A可見，4℃冷脅迫，水稻幼苗生長減慢，鮮重下降。由圖3-B—圖3-C可見，44℃熱脅迫，水稻幼苗的鮮重也有下降，但下降的幅度低于48℃熱脅迫處理。由圖3-D可見，淹脅迫對(duì)鮮重的影響不大。由圖3-E可見，恒暗處理會(huì)顯著降低鮮重，與株高類似，鮮重在第4天達(dá)到峰值，之后鮮重持續(xù)下降。由圖3-F可見，恒光處理對(duì)鮮重影響不大。由圖3-G可見，PEG處理對(duì)鮮重有一定影響。由圖3-H可見，鹽脅迫對(duì)幼苗鮮重也有比較明顯的影響。

此外，曾嘗試對(duì)根長進(jìn)行測(cè)量，但脅迫處理總體來講對(duì)根長影響不大，且根長的變化幅度較大，不太適合作為脅迫處理的標(biāo)志性指標(biāo)。

A：4℃冷脅迫，B：44℃熱脅迫，C：48℃熱脅迫，D：淹脅迫，E：持續(xù)黑暗脅迫，F(xiàn)：持續(xù)光照脅迫，G：旱（20% PEG6000）脅迫，H：0.2 mol·L-1 NaCl脅迫。A—C取材時(shí)間點(diǎn)為0、2、4、8、12、24、36和48 h。D取材時(shí)間點(diǎn)為0 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d。E、F取材時(shí)間點(diǎn)為：0 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d和8 d。G、H取材時(shí)間點(diǎn)為：0 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d。CK：正常培養(yǎng)條件，S：脅迫，CD：持續(xù)黑暗，CL：持續(xù)光照。下同

2.4 不同脅迫處理對(duì)水稻幼苗蛋白質(zhì)含量的影響

為了考察不同脅迫對(duì)總蛋白質(zhì)的影響，提取總蛋白質(zhì)后進(jìn)行了SDS-PAGE分離（圖4）。不同處理不同時(shí)間點(diǎn)的樣品均能看到比較典型的考染條帶。為了對(duì)總蛋白質(zhì)含量進(jìn)行定量比較，采集了考染信號(hào)（圖5）。在對(duì)照樣品中，由于水稻幼苗的快速生長，單位鮮重樣品中的蛋白質(zhì)含量略呈下降，但3種溫度脅迫處理均能提高總蛋白質(zhì)含量，且蛋白質(zhì)含量的提高在較短的時(shí)間內(nèi)（2 h）即可檢測(cè)到，說明總蛋白質(zhì)含量提高是水稻抵抗溫度逆境的一個(gè)重要方式。由圖5-D可見，淹脅迫對(duì)總蛋白質(zhì)的影響不大。恒暗處理（圖5-E）會(huì)明顯降低總蛋白質(zhì)的含量，說明光合作用的下降對(duì)蛋白質(zhì)的合成有較為重要的影響。另外，恒光處理（圖5-F）、干旱（圖5-G）和鹽脅迫（圖5-H）對(duì)總蛋白質(zhì)含量影響不大。

圖2 不同脅迫處理對(duì)水稻幼苗株高的影響

2.5 蛋白質(zhì)樣品資源庫RiceS-A300的建立

在對(duì)苗期水稻進(jìn)行多種脅迫并對(duì)表型進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查的基礎(chǔ)上，提取了不同時(shí)間點(diǎn)樣品的總蛋白質(zhì)，通過考染比較了總蛋白質(zhì)含量的變化，目前所獲得的蛋白質(zhì)總體積為2 mL，每次WB的用量為10 μL，樣品可供200次WB分析，統(tǒng)一編號(hào)標(biāo)注后用9×9的塑料樣品盒存放于-20℃冰箱，成為第一個(gè)版本的水稻幼苗非生物脅迫處理的蛋白質(zhì)樣品資源庫RiceS-A300。由于試驗(yàn)所采用的條件比較規(guī)范且容易控制，可根據(jù)需要重復(fù)擴(kuò)大樣品的規(guī)模。預(yù)期不同的實(shí)驗(yàn)室采用相同的條件獲得的蛋白質(zhì)樣品也能獲得可重復(fù)的試驗(yàn)結(jié)果。

圖3 不同脅迫處理對(duì)水稻幼苗鮮重的影響

2.6 基于RiceS-A300調(diào)查HSP82蛋白質(zhì)的表達(dá)特征

為了驗(yàn)證RiceS-A300資源庫的質(zhì)量并開展資源庫的應(yīng)用。用WB分析了HSP82的表達(dá)特征（圖6），采集了WB的信號(hào)，繪制成柱狀圖進(jìn)行定量分析（圖7）。為了比較不同WB之間的結(jié)果，以CR的信號(hào)為參照，對(duì)不同WB進(jìn)行歸一化處理。由圖7-A可見，4℃冷脅迫處理對(duì)HSP82蛋白質(zhì)表達(dá)的影響不大。由圖7-B和圖7-C可見，44℃和48℃熱脅迫處理，可明顯提高HSP82蛋白質(zhì)的表達(dá)，表達(dá)的提高在處理2小時(shí)即可觀察到。由圖7-D和5B-E可見，淹脅迫和恒暗處理對(duì)HSP82蛋白質(zhì)的表達(dá)影響不大。由圖7-F—圖7-H可見，恒光、PEG和鹽脅迫處理均能提升HSP82蛋白質(zhì)的表達(dá)，但其幅度遠(yuǎn)低于熱脅迫。

HSP82是MBB實(shí)驗(yàn)室鑒定的水稻蛋白質(zhì)內(nèi)參，該蛋白質(zhì)在多種水稻組織，甚至在其他植物樣品中都表達(dá)穩(wěn)定，目前該蛋白質(zhì)內(nèi)參已經(jīng)廣為應(yīng)用。本研究一方面檢測(cè)了RiceS-A300樣品資源庫的蛋白質(zhì)質(zhì)量，另一方面也在更大范圍內(nèi)檢測(cè)了HSP82蛋白質(zhì)的表達(dá)特征，是對(duì)早期工作的補(bǔ)充和驗(yàn)證[29]。早期試驗(yàn)中由于熱處理的時(shí)間點(diǎn)不多，也沒有采集信號(hào)進(jìn)行定量處理，未能獲得熱脅迫提高HSP82表達(dá)量的結(jié)論，本研究中由于有不同溫度、不同時(shí)間點(diǎn)和定量信號(hào)的分析，可以清楚地看到該蛋白質(zhì)的表達(dá)受熱脅迫的誘導(dǎo)。

SDS-PAGE條件：上樣量10 μL，電泳時(shí)間60 min，電壓160 V，膠濃度10%，電泳槽：Mini PROTEAN Tetra cell

3 討論

以水稻種子為起點(diǎn)，以水稻幼苗為材料，通過嚴(yán)格控制的條件進(jìn)行多種脅迫處理，包括冷、熱、旱、淹、鹽、恒光、恒暗等，調(diào)查了脅迫處理對(duì)表型、株高和鮮重的影響，在不同的時(shí)間點(diǎn)取材，共采集了約300個(gè)組織樣品，提取總蛋白質(zhì)，SDS-PAGE分離后進(jìn)行定量分析和評(píng)價(jià)后，形成了第一個(gè)版本的水稻蛋白質(zhì)樣品資源庫RiceS-A300，進(jìn)而用WB開展了內(nèi)參蛋白質(zhì)HSP82的表達(dá)特征分析。

在生命科學(xué)領(lǐng)域，隨著高通量分析測(cè)定技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生的信息資源也呈指數(shù)級(jí)增長，分析測(cè)定技術(shù)有時(shí)已經(jīng)不再是主要的研究瓶頸，生物資源卻是重要的限制因素。在人類組織樣品方面，科研人員對(duì)樣品的要求也在逐步提高，規(guī)范的、相關(guān)信息齊備的資源庫是重要項(xiàng)目的基本前提。能夠?yàn)檠芯咳后w共享的數(shù)據(jù)和實(shí)物資源具有重要的意義。在水稻中已經(jīng)積累了全基因組序列和多種時(shí)空條件下的轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)，也有一些基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)等數(shù)據(jù)資源，在實(shí)物資源庫方面，也有全基因組基因芯片、分子標(biāo)記探針、全長cDNA文庫、突變體庫等。蛋白質(zhì)樣品資源庫的建立將有助于推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，今后這方面的工作一定會(huì)得到加強(qiáng)。

圖5 脅迫處理后水稻幼苗地上部總蛋白質(zhì)的定量比較

結(jié)合本研究中所建立的水稻幼苗脅迫處理的蛋白質(zhì)樣品資源庫，認(rèn)為這一類資源庫應(yīng)滿足幾個(gè)條件：一是樣品來源要有保障，蛋白質(zhì)的量總是有限的，樣品是需要補(bǔ)充的，所以樣品制備條件要能重復(fù)，即使在不同實(shí)驗(yàn)室間也能重復(fù)。本研究從水稻種子起始，在嚴(yán)格控制的生長條件下進(jìn)行培養(yǎng)和脅迫處理，以便盡可能保證樣品的來源可重復(fù)。二是資源庫樣品的相對(duì)穩(wěn)定性，與DNA樣品不同，蛋白質(zhì)樣品的貯存要困難的多，但經(jīng)過100℃處理后的樣品在-20℃冰箱貯存1—2年的時(shí)間，仍然能夠獲得可以重復(fù)的WB結(jié)果。三是樣品質(zhì)量可以跟蹤和核查，通過對(duì)內(nèi)在的標(biāo)志物蛋白質(zhì)的檢測(cè)，可檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量。四是資源庫可以共享給研究同行，蛋白質(zhì)資源庫的建立對(duì)試驗(yàn)的要求很高，經(jīng)過鑒定的資源庫可作為公共平臺(tái)，共享給研究同行使用，這樣可節(jié)約社會(huì)成本，增加不同實(shí)驗(yàn)室間試驗(yàn)結(jié)果的可比性。

WB條件：上樣量10 μL，電泳時(shí)間60 min，電壓160 V，膠濃度10%，電泳槽Mini PROTEAN Tetra cell，轉(zhuǎn)膜時(shí)間60 min，轉(zhuǎn)膜電壓100 V，膜PVDF，一抗：抗HSP82抗體，二抗：羊抗鼠二抗

在建立蛋白質(zhì)資源庫的基礎(chǔ)上，檢測(cè)了HSP82蛋白質(zhì)在脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)特征，HSP82是MBB實(shí)驗(yàn)室在2012年鑒定的一個(gè)水稻內(nèi)參蛋白質(zhì)[29]，該蛋白質(zhì)在WB檢測(cè)的幾十種水稻樣品中都呈現(xiàn)組成型表達(dá)，且信號(hào)穩(wěn)定，目前，該內(nèi)參蛋白質(zhì)已經(jīng)被許多水稻乃至其他植物研究同行采用[30-32]。本研究證明了該蛋白質(zhì)在冷、旱、鹽、淹、恒光、恒暗等脅迫條件下的幼苗中也相對(duì)表達(dá)穩(wěn)定，這一結(jié)果擴(kuò)展了該內(nèi)參蛋白質(zhì)的應(yīng)用范圍，而在熱脅迫處理過程中其表達(dá)量上調(diào)，在WB水平證明它確實(shí)也是一個(gè)熱激蛋白。HSP82蛋白質(zhì)的WB分析結(jié)果也可作為檢測(cè)資源庫質(zhì)量的一個(gè)指標(biāo)。

只要具備了抗體，可以采用本研究建立的蛋白質(zhì)樣品資源庫調(diào)查目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)特征，MBB實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)進(jìn)行了多個(gè)蛋白激酶、WRKY轉(zhuǎn)錄因子、PR等蛋白質(zhì)的WB分析，發(fā)現(xiàn)了一些特定誘導(dǎo)表達(dá)的信息（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

為了對(duì)不同WB試驗(yàn)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，本研究中在所有的WB試驗(yàn)中都加入了共同參照樣品CR（common reference），通過CR信號(hào)調(diào)平不同WB間的信號(hào)強(qiáng)度就可以進(jìn)行不同樣品信號(hào)強(qiáng)度的比較。

在脅迫處理時(shí)間的選擇上，基本的標(biāo)準(zhǔn)是能夠肉眼觀察到明顯的表型變化，在這樣的時(shí)間范圍內(nèi)再設(shè)置多個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，以便持續(xù)地觀察表型，了解表型，了解蛋白質(zhì)分子表達(dá)特征的變化過程。一般來說，在水稻幼苗發(fā)生可見的形態(tài)變化之前，分子特征會(huì)先出現(xiàn)，分子特征出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)、強(qiáng)度變化的幅度都是重要的脅迫應(yīng)答指標(biāo)。

圖7 不同脅迫處理?xiàng)l件下水稻幼苗地上部HSP82蛋白質(zhì)的定量比較

本研究所建立的RiceS-A300資源庫可為研究同行提供便利，所提出的蛋白質(zhì)樣品資源庫建設(shè)流程和評(píng)價(jià)體系也可供植物同行參考。

4 結(jié)論

4.1 對(duì)水稻幼苗進(jìn)行了多種非生物逆境處理，調(diào)查了脅迫處理過程中9個(gè)時(shí)間點(diǎn)的幼苗表型、株高、鮮重和總蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)：淹脅迫促進(jìn)株高伸長，其他脅迫均對(duì)株高伸長有抑制；4℃和恒暗處理降低鮮重，其他脅迫影響不大；3種溫度脅迫都能提高總蛋白質(zhì)含量，恒暗脅迫會(huì)降低總蛋白質(zhì)含量，其他脅迫對(duì)總蛋白質(zhì)含量影響不大。

4.2 累計(jì)收集了約300份蛋白質(zhì)樣品，建立了第一版的脅迫處理?xiàng)l件下的水稻幼苗蛋白質(zhì)樣品資源庫（RiceS-A300）。

4.3 利用RiceS-A300，通過WB調(diào)查了HSP82蛋白質(zhì)的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)其在熱脅迫下特異誘導(dǎo)表達(dá)。

4.4 提出并建立了蛋白質(zhì)樣品資源庫建設(shè)和評(píng)價(jià)的流程。

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（責(zé)任編輯 李莉）

The Establishment and Application of Rice Protein Sample Library RiceS-A300

ZHANG JianShuo, MA JinJiao, ZHANG Tong, CHEN Yue, WEI Jian, ZHANG Liu, SHI JiaNan, XU Shan, YAN GaoWei, DU TieMin, DOU ShiJuan, LI LiYun, LIU LiJuan, LIU GuoZhen

(College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei)

【Objective】 The aim of the study is establish a protein sample library namely RiceS-A300, which was collected from rice seedlings treated by abiotic stressed conditions and investigate the expression patterns of the reference protein HSP82 by Western blot analysis using the library of RiceS-A300. 【Method】The seeds of japonica rice variety TP309 were soaked in water for 3 days at 30℃, and then cultured either in soil mixture (soil and vermiculite 1:1) or aquaculture condition at 30℃ with photoperiod L12 h/D12 h for 5 days. Then the seedlings were treated by cold (4℃), heat (44℃ and 48℃), submerge, constant light, constant dark, PEG 6000 (20%) and NaCl (0.2 mol·L-1), while the seedlings cultured at 30℃ with photoperiod L12 h/D12 h was used as control. Rice seedlings were monitored, photographed and samples were collected at different time points, the plant height and fresh weight were measured under different stressed conditions. To establish a library of protein samples total proteins were extracted from rice seedlings. SDS-PAGE separated proteins were stained with coomassie blue to evaluate the quality of protein sample. Western blot (WB) was carried out to investigate the expression patterns of reference protein HSP82. 【Result】The phenotype, plant height, fresh weight and total protein content of rice seedlings at 9 time points under various stressed conditions were investigated. It was found that cold (4℃), hot (44℃ and 48℃) stresses demonstrated the inhibitory effect of the elongation of plant height in 2 d, while the submerge treatment promotes the elongation of plant height. Constant dark and constant light inhibited the elongation of plant height, the seedlings became yellow under the constant dark treatment. PEG and NaCl treatments had an inhibitory effect on the plant height also, and the leaf tip was dry under NaCl stress at 5 d. The results for fresh weight investigation showed that cold (4℃), hot (44℃ and 48℃), PEG and NaCl stresses reduced the fresh weight of the seedlings, while the submerge treatment had little effect on the fresh weight, constant dark treatment reduced the fresh weight but constant light treatment had no obvious effect. The three kinds of temperature stresses increased the total protein content, and constant dark stress decreased the total protein content, the other stresses had little effect on the total protein content. Collectively, a total of approximately 300 protein samples are collected，the rice protein sample library (RiceS-A300) was established. The total volume of each sample was 2 ml, enough for about 200 WBs. As standard operational protocol was used for sample collection and protein isolation, the scale of sample can be enlarged. It is expecting that repeatable results can be achieved from different laboratories using similar treatment conditions. RiceS-A300 was used to investigate the expression patterns of HSP82 protein, the results showed that heat stress increased the expression of HSP82 significantly, constant light, PEG and NaCl stresses increased the expression of HSP82 slightly, cold stress, submerge and constant dark had little effect on the abundance of HSP82 protein.【Conclusion】This study proposed a process for the construction and evaluation of the protein sample library, and the first version of the library (RiceS-A300) derived from rice seedlings under different stressed conditions was established. On the basis of RiceS-A300, the expression patterns of reference protein HSP82 was investigated using WB and it was found that HSP82 was specifically induced under heat stress.

rice; protein sample library; reference protein; western blot; heat shock protein

2018-04-11；

2018-05-17

國家自然科學(xué)基金（31171528）

張劍碩，E-mail：zhangjianshuo_mbb@126.com。 通信作者劉國振，Tel：0312-7528787；E-mail：gzhliu@hebau.edu.cn