王心如， 鄒盛之， 馮文慶， 張耀鵬， 張佳明， 邵惠麗

(1.東華大學(xué) a.纖維材料改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; b.材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620；2．復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 老年科，上海 200040)

生物醫(yī)用材料是一類與生命系統(tǒng)相作用，用以診斷、治療、修復(fù)和替代人體病變或損傷的組織、器官，或增進(jìn)其功能的材料[1]。目前，正在研究及已得到應(yīng)用的生物醫(yī)用材料很多，例如硅橡膠、膠原蛋白、甲殼胺、尼龍、聚酯等，它們各有其特點(diǎn)，但有些合成材料的生物相容性不足，有些天然材料則提純比較困難，成本較高[1-2]。

相比之下，天然蠶絲是一種容易獲得且價(jià)格相對(duì)便宜的生物材料，由于其具有優(yōu)良的柔韌性、吸濕性、透氣性和優(yōu)雅的光澤而被人們熟知。蠶絲中含有生物相容性良好的絲素蛋白，而絲素蛋白自身及降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞和機(jī)體無(wú)毒，不會(huì)或較少引起炎癥和免疫排斥反應(yīng)，從而使得蠶絲在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究得到迅速發(fā)展。蠶絲可分為家蠶絲與野蠶絲兩大類，家蠶絲主要指桑蠶絲，野蠶絲則包括柞蠶絲、天蠶絲、蓖麻蠶絲等，其中柞蠶絲在我國(guó)資源豐富、分布廣闊。目前，中國(guó)柞蠶繭每年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的90%左右[3]。近年來(lái)，人們對(duì)蠶絲絲素蛋白的研究逐漸轉(zhuǎn)向分子水平。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，柞蠶絲中的絲素蛋白(ASF)具備一般蠶絲絲素蛋白所不具備的優(yōu)點(diǎn)，即ASF中含有大量的精氨酸-甘氨酸-天門(mén)冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)三肽序列，經(jīng)證明該序列對(duì)細(xì)胞的黏附有利[4]，因此，利用ASF制備的生物組織工程支架在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有較大的應(yīng)用前景。

為了制備ASF多孔組織工程支架材料，冷凍干燥技術(shù)是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)高效的成型方法。但研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)冷凍干燥法直接得到的ASF材料是溶于水的，尚無(wú)法有效應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。人們?cè)趯?duì)家蠶絲素蛋白(BSF)的研究中發(fā)現(xiàn)，采用某些方法可使絲素蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而使制備的材料不溶于水。其中，用乙醇處理是最簡(jiǎn)單和可靠的方法。目前，有些研究小組已報(bào)道了乙醇影響B(tài)SF構(gòu)象的研究結(jié)果[5-7]。然而，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道在溶液中直接加入乙醇誘導(dǎo)ASF成膠、再冷凍干燥制備ASF多孔材料。

為此，本研究以柞蠶絲為原料，采用乙醇促使ASF溶液快速凝膠并進(jìn)一步冷凍干燥的方法制備ASF多孔材料，然后通過(guò)傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、掃描電子顯微鏡(SEM)探討了乙醇水溶液濃度及ASF初始濃度對(duì)ASF樣品結(jié)構(gòu)的影響。采用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)對(duì)ASF多孔材料的生物相容性進(jìn)行初探，本研究有望對(duì)制備性能優(yōu)良的ASF組織工程支架材料提供一定的理論指導(dǎo)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

柞蠶絲，購(gòu)自遼寧丹東(市售)。無(wú)水碳酸鈉(Na2CO3)(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，硫氰酸鋰(LiSCN)(分析純，西格瑪奧德里奇有限公司)，纖維素透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為14 000±2 000)(上海源聚生物科技有限公司)，無(wú)水乙醇(分析純，江蘇常熟市鴻盛精細(xì)化工有限公司)，雪旺細(xì)胞(SCs細(xì)胞株)(中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)，鬼筆環(huán)肽(Alexa Fluor?568 phalloidin)(英杰生命科技有限公司)，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

MDF-192型超低溫冰柜(日本SANYO公司)，F(xiàn)D-1A-50型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，Nicolet 8700型傅里葉變換紅外光譜(美國(guó)熱電公司)，JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(SEM)(日本電子株式會(huì)社)，TCS SP5 Ⅱ型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)。

1.3 再生柞蠶絲素蛋白水溶液的制備

將柞蠶絲放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的Na2CO3水溶液中，浴比1︰50，在100 ℃下脫膠30 min，重復(fù)該過(guò)程3次，用去離子水充分洗滌，然后干燥獲得脫膠絲。將脫膠絲以1︰10的浴比在50 ℃下溶解于9.0 mol/L的LiSCN水溶液中，經(jīng)離心過(guò)濾后將濾液裝入纖維素透析袋，在4 ℃下用去離子水透析后進(jìn)一步濃縮形成初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、6%、8%和10%的再生ASF水溶液，并將它們分別等體積置于不同的燒杯中待用。

1.4 再生柞蠶絲素蛋白多孔材料的制備

向上述各種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的再生ASF水溶液中以1︰1的體積比分別加入70%、80%、90%和100%的乙醇水溶液或純乙醇，將混合溶液于4 ℃下靜置使其形成凝膠后，采用MDF-192型超低溫冰柜在-50 ℃下對(duì)其進(jìn)一步冷凍24 h，然后采用FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)進(jìn)行減壓干燥，得到再生ASF多孔材料(簡(jiǎn)稱ASF凍干樣品)。

1.5 再生柞蠶絲素蛋白樣品結(jié)構(gòu)與性能的表征

采用Nicolet 8700型傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀，通過(guò)ATR法對(duì)再生ASF凝膠及其冷凍干燥后樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。測(cè)定波數(shù)范圍為4 000～525 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32次。

上述樣品的FTIR譜圖的酰胺Ⅰ區(qū)(1 600～1 700 cm-1)中，各子峰與絲素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下[8-10]：1 600～1 640 cm-1為β-折疊構(gòu)象，1 640～1 660 cm-1為α-螺旋或無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象，1 660～1 690 cm-1為β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象。按文獻(xiàn)[11]所述方法用Peakfit軟件采用高斯函數(shù)對(duì)樣品譜圖進(jìn)行曲線擬合，根據(jù)歸一化后各子峰的積分面積計(jì)算ASF樣品中對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)百分含量。

采用JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(SEM)在10 kV電壓下對(duì)表面經(jīng)噴金處理的ASF凍干樣品的形態(tài)進(jìn)行觀察及拍照，并用圖像處理軟件(Nano Measurer)分析電鏡照片中100個(gè)孔的尺寸，由此得到樣品的平均孔徑及孔徑分布。

參考文獻(xiàn)[12]方法，在再生ASF多孔材料(ASF水溶液初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，乙醇誘導(dǎo)采用純乙醇)上接種雪旺細(xì)胞(SCs)，培養(yǎng)第4天后用鬼筆環(huán)肽和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察接種在多孔材料上的細(xì)胞形貌。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇誘導(dǎo)柞蠶絲素蛋白結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

ASF分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括β-折疊構(gòu)象、α-螺旋構(gòu)象和無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象，另外還有部分的中間態(tài)構(gòu)象(即β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象)[13-14]。圖1是不同ASF樣品的FTIR圖譜。其中，圖1(a)為天然柞蠶絲經(jīng)脫膠后的樣品結(jié)果，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，脫膠柞蠶絲在1 625 cm-1(酰胺Ⅰ)、1 520 cm-1(酰胺Ⅱ)、1 237 cm-1(酰胺Ⅲ)、962 cm-1(酰胺Ⅳ)和700 cm-1(酰胺Ⅴ)處的吸收峰均屬于絲素蛋白β-折疊構(gòu)象[15-16]，621 cm-1(酰胺Ⅴ)處的吸收峰則屬于α-螺旋構(gòu)象[17]。由此可見(jiàn)，脫膠柞蠶絲樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊構(gòu)象為主。

圖1 不同ASF樣品的FTIR圖譜Fig.1 FTIR spectra of different ASF samples

圖1(b)反映的是初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的再生ASF水溶液的紅外結(jié)果。考慮到乙醇處理過(guò)程是在其中以1︰1的體積比加入乙醇或乙醇水溶液，混合溶液中ASF的質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)下降至2%左右，為了便于比較分析，圖1(c)進(jìn)一步給出了2%再生ASF水溶液的FTIR結(jié)果?？梢园l(fā)現(xiàn)，圖1(b)與圖1(c)具有相同的出峰位置，其中1 645 cm-1(酰胺Ⅰ)處較尖銳的峰是絲素蛋白無(wú)規(guī)線團(tuán)/α-螺旋構(gòu)象所致[18-19]，而700 cm-1(酰胺Ⅴ)處屬于β-折疊構(gòu)象的峰相對(duì)較弱。由此可見(jiàn)，與上述脫膠柞蠶絲相比，再生ASF水溶液中β-折疊構(gòu)象要少得多。

圖1(d)是乙醇誘導(dǎo)ASF水溶液所形成的凝膠的FTIR圖譜，較明顯看出，該譜圖的吸收峰位置和脫膠柞蠶絲樣品(圖1(a))的紅外吸收峰位置類似，1 630 cm-1(酰胺Ⅰ)、1 522 cm-1(酰胺Ⅱ)、1 241 cm-1(酰胺Ⅲ)、965 cm-1(酰胺Ⅳ)和700 cm-1(酰胺Ⅴ)處是絲素蛋白β-折疊構(gòu)象的典型吸收峰，621 cm-1(酰胺Ⅴ)處為絲素蛋白α-螺旋構(gòu)象的吸收峰。從紅外光譜變化來(lái)看，乙醇誘導(dǎo)溶液成膠后，ASF凝膠的紅外譜圖(圖1(d))出現(xiàn)了明顯的β-折疊構(gòu)象的吸收帶。對(duì)圖1(b～d)曲線的酰胺Ⅰ區(qū)按文獻(xiàn)[8]提及方法進(jìn)行分峰處理，可得到各樣品中不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，其中2%和4%再生ASF水溶液中的β-折疊構(gòu)象含量分別僅為10.9%和13.0%，而添加乙醇后得到的凝膠中β-折疊構(gòu)象的含量升至26.5%，這表明ASF溶液在乙醇的誘導(dǎo)作用下形成凝膠后，部分ASF分子由原來(lái)的α-螺旋/無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象轉(zhuǎn)變成了β-折疊構(gòu)象。

圖1(e)是上述ASF凝膠冷凍干燥后樣品的FTIR圖譜。由圖1(e)可知，該樣品紅外光譜的出峰位置和圖1(d)基本一致，但酰胺Ⅰ區(qū)屬于β-折疊構(gòu)象的吸收帶略往低波數(shù)方向移動(dòng)至1 624 cm-1處。據(jù)文獻(xiàn)[20]報(bào)道，酰胺Ⅰ區(qū)(1 600～1 700 cm-1)的產(chǎn)生主要由C—O伸縮振動(dòng)貢獻(xiàn)，且易受到氫鍵效應(yīng)的影響。氫鍵的產(chǎn)生會(huì)引起伸縮振動(dòng)頻率向低波數(shù)方向偏移，由此說(shuō)明了ASF凝膠冷凍干燥得到的ASF樣品中含有更多的氫鍵。定量分析結(jié)果顯示，ASF凍干樣品中β-折疊構(gòu)象含量也更高，這可能是因?yàn)樵贏SF凝膠冷凍干燥過(guò)程中，冰晶會(huì)對(duì)絲素蛋白產(chǎn)生類似剪切的作用而誘導(dǎo)絲素蛋白由α-螺旋/無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變[21-22]，使得ASF樣品中形成更多的分子間氫鍵。因此，與ASF凝膠相比，ASF凍干樣品在酰胺Ⅰ區(qū)的吸收帶略往低波數(shù)方向移動(dòng)(更接近于脫膠柞蠶絲)。

2.2 乙醇水溶液濃度對(duì)ASF凝膠及其凍干樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)本研究中FTIR測(cè)試結(jié)果并結(jié)合文獻(xiàn)[23-25]，一方面，在ASF水溶液中加入乙醇會(huì)使乙醇分子更多地與水分子結(jié)合，破壞水分子與絲素蛋白分子的結(jié)合，從而使得絲素蛋白分子之間的相互作用增強(qiáng)，導(dǎo)致絲素蛋白分子間形成更多的氫鍵，生成更多β-折疊構(gòu)象。另一方面，ASF富含聚丙氨酸序列，該序列表現(xiàn)出很強(qiáng)的疏水性。而乙醇分子中的乙基與ASF中丙氨酸鏈段的結(jié)構(gòu)較為相似，推測(cè)能與其相似相溶，故在ASF水溶液中加入乙醇后，絲素蛋白的疏水基團(tuán)與乙醇分子的相互作用逐漸增強(qiáng)，削弱了絲素蛋白分子在疏水區(qū)域之間的相互作用，促進(jìn)了這些疏水鏈段的活動(dòng)，從而導(dǎo)致絲素蛋白從高能量的無(wú)規(guī)線團(tuán)/α-螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榈湍芰康摩?折疊構(gòu)象。當(dāng)β-折疊構(gòu)象的含量增加到某個(gè)臨界值時(shí)，ASF水溶液中就出現(xiàn)了不溶物，隨著不溶物尺寸和數(shù)目不斷增多，體系的流動(dòng)性逐漸變差，最終形成凝膠。

研究表明，在正常情況下ASF凝膠過(guò)程十分緩慢，將低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(如4%或2%)的ASF水溶液置于4 ℃的溫度下，經(jīng)過(guò)兩周仍無(wú)凝膠現(xiàn)象產(chǎn)生。而在與一定量的乙醇作用后，即有部分絲素蛋白變性成白色絮狀物，這些白色絮狀絲素蛋白就是前述的不溶物。當(dāng)水溶液中ASF含量一定時(shí)，隨著乙醇濃度的提高，溶液中出現(xiàn)的白色絮狀物增多，凝膠過(guò)程也大幅加速。當(dāng)乙醇濃度僅為70%時(shí)，體系完全形成凝膠的時(shí)間需20 h以上；當(dāng)乙醇濃度上升至80%及90%時(shí)，溶液中出現(xiàn)白色絮狀物的速度加快，且凝膠時(shí)間分別縮短至7 h和5 h；而當(dāng)乙醇濃度達(dá)到100%時(shí)，溶液中很快出現(xiàn)白色絮狀物，凝膠時(shí)間僅需3 h。

圖2反映了乙醇水溶液濃度對(duì)ASF凝膠及其凍干樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。在不同乙醇濃度下，ASF凝膠中β-折疊構(gòu)象含量均比其進(jìn)一步冷凍干燥后的樣品低，這再次佐證了上一節(jié)的相關(guān)結(jié)論。從圖2中a曲線還可以看出，乙醇濃度的增加能使ASF凝膠中β-折疊構(gòu)象的含量增多。這是因?yàn)槿芤褐幸掖紳舛仍礁?，有越多的乙醇分子?huì)與水分子結(jié)合，從而破壞水分子與絲素蛋白分子結(jié)合，導(dǎo)致絲素蛋白分子之間的相互作用增強(qiáng)，這種情況下形成β-折疊構(gòu)象的速度更快，凝膠中β-折疊構(gòu)象的含量相對(duì)更多。此外，乙醇濃度越高意味著有更多的乙醇分子會(huì)與絲素蛋白的疏水基團(tuán)發(fā)生相互作用，使得疏水鏈段的活動(dòng)能力加快，從而導(dǎo)致更多的無(wú)規(guī)線團(tuán)/α-螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊構(gòu)象。

圖2 乙醇水溶液濃度對(duì)ASF凝膠及其進(jìn)一步凍干后樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the secondary structure of ASF gel and freeze-dried ASF samples

從圖2中b曲線進(jìn)一步可以看出，ASF凝膠冷凍干燥后的樣品也有類似的結(jié)果，當(dāng)乙醇水溶液濃度從70%上升至100%時(shí)，ASF凍干樣品中β-折疊構(gòu)象的含量從29.6%增加至36.5%。由此可見(jiàn)，提高乙醇誘導(dǎo)過(guò)程中采用的乙醇水溶液濃度，將促進(jìn)冷凍干燥法ASF材料中β-折疊構(gòu)象的形成。

2.3 ASF初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)ASF凝膠及其凍干樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖3反映了ASF初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)ASF凝膠及其進(jìn)一步凍干后樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ASF初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)從4%上升至10%時(shí)，ASF凝膠中的β-折疊構(gòu)象含量(圖3(a))從26.5%提高到33.0%，而α-螺旋/無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象含量則從54.7%降至43.9%，這說(shuō)明ASF初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加有利于凝膠中β-折疊構(gòu)象的形成。ASF初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，越能減少絲素蛋白分子與水分子結(jié)合的幾率，使得絲素蛋白分子鏈相互碰撞的機(jī)會(huì)更大，絲素蛋白分子之間的相互作用也更強(qiáng)。

圖3 ASF初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)ASF凝膠及其進(jìn)一步凍干后樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of original ASF concentration on the secondary structure of ASF gel and freeze-dried ASF samples

隨著絲素蛋白分子間相互作用的增強(qiáng)，ASF水溶液成膠的過(guò)程中形成β-折疊構(gòu)象的速度將變快，從而導(dǎo)致β-折疊構(gòu)象的含量更多。ASF初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)ASF凝膠進(jìn)一步凍干后樣品二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響也有類似的結(jié)果(圖3(b))，當(dāng)ASF初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)從4%上升至10%時(shí)，ASF凍干樣品中β-折疊構(gòu)象的含量隨之從36.5%提高至46.1%，而α-螺旋/無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象的含量則從42.0%降至33.5%。由此可見(jiàn)，ASF水溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的適當(dāng)提高，有利于冷凍干燥法ASF材料中絲素蛋白構(gòu)象向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變。

2.4 ASF初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)與乙醇水溶液濃度對(duì)ASF凍干樣品微觀結(jié)構(gòu)的影響

由前述可知，ASF凝膠中β-折疊構(gòu)象含量已明顯高于ASF水溶液，但仍不占主導(dǎo)地位，這導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)不是非常穩(wěn)定。因此，在對(duì)ASF樣品進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)分析時(shí)，主要采用由凝膠進(jìn)一步冷凍干燥處理后的樣品。圖4為由不同初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)的ASF水溶液制得的ASF凍干樣品橫截面的SEM照及對(duì)應(yīng)的孔徑分布結(jié)果，從中可以看出，ASF水溶液初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，樣品截面中空隙形態(tài)大體呈無(wú)規(guī)則(故無(wú)法分析其孔徑分布，圖4(a)中無(wú)所對(duì)應(yīng)的孔徑分布圖)，這可能是由于ASF質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低使得材料強(qiáng)度不高，導(dǎo)致制樣及測(cè)試中材料形態(tài)易被破壞。而當(dāng)溶液中ASF含量逐漸增大時(shí)，樣品截面的形態(tài)也變得更有規(guī)則，逐漸呈現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)。從圖4(b～d)右側(cè)所對(duì)應(yīng)的各樣品孔徑分析結(jié)果可以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ASF水溶液的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)從6%上升至10%時(shí)，樣品的平均孔徑從30.4 μm減小至18.8 μm。這可能是因?yàn)槿芤褐蠥SF含量較高時(shí)，冷凍過(guò)程中ASF分子對(duì)水分子運(yùn)動(dòng)的阻力較大，不利于形成大的冰晶，故所制得的ASF多孔材料的孔徑相對(duì)較小。

圖4 由不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的ASF水溶液制得的ASF凍干樣品橫截面的SEM照片及對(duì)應(yīng)的孔徑分布Fig.4 SEM images and pore size distribution histograms of freeze-dried ASF samples prepared from ASF aqueous solution with different concentrations

圖5進(jìn)一步給出了采用不同濃度的乙醇水溶液誘導(dǎo)制得的ASF凍干樣品橫截面的SEM照片。由圖5可知，隨乙醇水溶液濃度的增加，ASF樣品的平均孔徑呈一定的上升趨勢(shì)。由文獻(xiàn)[26-27]可知，孔徑在10～20 μm的微小孔洞能基本滿足細(xì)胞黏附及生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)的要求，孔徑介于20～100 μm的多孔材料在動(dòng)物表皮細(xì)胞培養(yǎng)及載入生長(zhǎng)因子方面具有一定的應(yīng)用前景[28]，而更大孔洞則有利于細(xì)胞生長(zhǎng)[29]。因此，為了驗(yàn)證所制備的ASF多孔材料能否滿足細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)的需求，本研究進(jìn)一步考察了其生物相容性。

2.5 再生柞蠶絲素蛋白多孔材料的生物相容性評(píng)價(jià)

選擇ASF質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%、純乙醇誘導(dǎo)作為優(yōu)選條件來(lái)制備多孔材料。細(xì)胞在材料上的生長(zhǎng)數(shù)目和形態(tài)可直觀體現(xiàn)生物相容性。圖6顯示了SCs在ASF多孔材料和蓋玻片材料上接種4 d后的激光掃描共聚焦顯微鏡圖(采用鬼筆環(huán)肽和DAPI分別對(duì)細(xì)胞的骨架和細(xì)胞核進(jìn)行染色)。從圖6中可以看出，ASF多孔材料和蓋玻片上的細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)很多是圓形，部分細(xì)胞出現(xiàn)了偽足。并且，相比于蓋玻片，SCs在ASF多孔材料上生長(zhǎng)得更為密集，細(xì)胞數(shù)目和偽足更多，這說(shuō)明ASF多孔材料比蓋玻片更能促進(jìn)細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。因此，本研究所制備的ASF多孔材料可作為組織工程支架應(yīng)用在生物醫(yī)療領(lǐng)域，并具有較大的潛在價(jià)值。

3 結(jié) 論

本研究以柞蠶絲為原料，采用乙醇促使ASF水溶液快速凝膠并進(jìn)一步冷凍干燥的方法，制備了ASF多孔材料，得到以下結(jié)論：

1)乙醇能誘導(dǎo)ASF水溶液形成凝膠，且形成凝膠的過(guò)程中伴隨有大量β-折疊構(gòu)象的產(chǎn)生。

2)隨乙醇水溶液濃度的升高及ASF水溶液初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，凝膠中β-折疊含量也相應(yīng)上升。

3)提高乙醇水溶液濃度或適當(dāng)降低ASF水溶液初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)，有利于獲得孔徑較大的冷凍干燥法ASF多孔材料。

4)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所制備的ASF多孔材料可作為組織工程支架應(yīng)用在生物醫(yī)用領(lǐng)域，并具有較大的潛在價(jià)值。