顏曉紅，李友筑，周衛(wèi)東，林莉，吳榮鋒，陶萍，余裕爐

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廈門 361003)

胚胎體外培養(yǎng)是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的關(guān)鍵技術(shù)，為了減少開(kāi)放式培養(yǎng)體系中CO2培養(yǎng)箱內(nèi)及室外環(huán)境劇烈變化對(duì)胚胎造成傷害，增加CO2培養(yǎng)箱數(shù)目、安裝復(fù)合式玻璃小門以減小開(kāi)門次數(shù)和面積以保持胚胎培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性是目前可行的主要措施，但其代價(jià)十分昂貴，且可靠性也有待商榷[1-2]。近年來(lái)，因大氣污染導(dǎo)致人類生育功能下降的報(bào)道時(shí)有發(fā)生[3]。1988年Ranoux等[4]首次將人類卵子與精子密封于塑料冷凍管中，置受試者的陰道內(nèi)培養(yǎng)48～52 h，將發(fā)育到4-細(xì)胞期的胚胎植入子宮后獲得了正常妊娠和分娩，但仍與空氣相接觸，其效果與常規(guī)開(kāi)放式培養(yǎng)相同。本研究通過(guò)在小鼠胚胎中進(jìn)一步探索密閉培養(yǎng)系統(tǒng)的可靠性，試圖建立新的胚胎體外培養(yǎng)體系。

材料與方法

一、研究對(duì)象

實(shí)驗(yàn)所用SPF級(jí)昆明小鼠，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。雄鼠4只，8周齡，體重大于25 g；雌鼠16只，8周齡，體重大于20 g。小鼠在室溫22～25℃、濕度40%～60%、光照交替(14 h光照、10 h黑暗)的SPF條件下喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前4 d，雌性昆明小鼠腹腔注射10 U的孕馬血清促性腺激素(PMSG)，48 h后腹腔注射10 U人絨毛膜促性腺激素(HCG)。將注射了HCG的雌鼠與雄性昆明小鼠進(jìn)行交配，交配成功以陰道栓的有無(wú)來(lái)判斷。

二、主要試劑和儀器

1.主要試劑：PMSG、HCG均購(gòu)自寧波激素制品廠；配子處理、胚胎操作以及胚胎培養(yǎng)等相關(guān)試劑均為瑞典Vitrolife公司產(chǎn)品。

2.主要儀器：解剖顯微鏡、倒置顯微鏡和相差顯微鏡(Olympus，美國(guó))；CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)和超低溫冰箱(Thermo，美國(guó))；臺(tái)式高壓鍋(山東新華醫(yī)療)，電熱恒溫水浴箱(為上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備)，DT-200小鼠跳臺(tái)測(cè)試箱、水迷宮(成都泰盟科技)。密閉培養(yǎng)設(shè)備為本院自己設(shè)計(jì)制造并獲國(guó)家發(fā)明專利(專利號(hào)：ZL 2016 1 0707688.6)。

三、小鼠卵母細(xì)胞的收集與胚胎體外培養(yǎng)

頸椎脫臼法處死超排卵母鼠，取出卵巢、輸卵管和子宮，在實(shí)體解剖鏡下，用眼科鑷子撕開(kāi)輸卵管傘，用安裝有4號(hào)針頭(已斷尖)的注射器抽取1～2 ml已預(yù)溫的G-MOPS液沖洗輸卵管與子宮，收集各發(fā)育階段的卵與胚胎。為了觀察所取卵母細(xì)胞情況，用0.1%透明質(zhì)酸酶去除卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞后，直接在實(shí)體解剖鏡或倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)和觀察；為了觀察卵母細(xì)胞的受精和發(fā)育情況，則采用0.1%透明質(zhì)酸酶去除其周圍的卵丘細(xì)胞后，經(jīng)G-IVF-plus洗3次，移入G-1-plus培養(yǎng)滴中(20～30枚/50 μl)，覆蓋礦物油，在37℃、5% CO2、飽和濕度的條件下，置CO2箱中培養(yǎng)12～24 h；2-細(xì)胞胚胎自輸卵管或子宮沖出后，在倒置顯微鏡下觀察與記錄，以備小鼠胚胎移植與著床點(diǎn)觀察。

四、胚胎密閉培養(yǎng)

本研究所用密閉培養(yǎng)設(shè)備如圖1所示。將該裝置預(yù)先放入Thermo 3111培養(yǎng)箱中(37℃、6% CO2、飽和濕度)并旋開(kāi)蓋子于通氣狀態(tài)(圖1A、1C)下備用。胚胎培養(yǎng)采用3001培養(yǎng)皿制備微滴進(jìn)行培養(yǎng)，方法同常規(guī)培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿放入密閉培養(yǎng)裝置中(圖1B、1D)，蓋上蓋子但不密封，使設(shè)備處于通氣狀態(tài)，在培養(yǎng)箱中平衡30 min，隨后蓋緊蓋子使設(shè)備處于密封狀態(tài)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，然后換囊胚培養(yǎng)液繼續(xù)密閉培養(yǎng)24 h。

A.密閉培養(yǎng)設(shè)備外觀圖；B.內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖；C.通氣孔；D.密封圈圖1 胚胎密閉式培養(yǎng)設(shè)備圖

常規(guī)培養(yǎng)組(對(duì)照組)中，胚胎采用常規(guī)方法培養(yǎng)，培養(yǎng)皿置于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下的CO2箱中培養(yǎng)；囊胚培養(yǎng)時(shí)放入低氧的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

本研究中，根據(jù)G系列培養(yǎng)液說(shuō)明書(shū)要求的時(shí)間進(jìn)行換液。兩組研究中，卵裂胚采用G1-plus培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，囊胚采用G2-plus培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

五、小鼠胚胎移植與著床點(diǎn)觀察

1.小鼠胚胎移植：收集小鼠2-細(xì)胞胚胎，分成密閉培養(yǎng)組和對(duì)照組，分別體外培養(yǎng)至囊胚期以供移植。采用子宮內(nèi)移植的手術(shù)方法進(jìn)行移植，受體鼠每側(cè)子宮移植7～8個(gè)胚胎，操作后在解剖顯微鏡下檢查移植管中有無(wú)余留胚胎。移植結(jié)束，復(fù)位縫合。為確定移入胚胎的分布，在移入后的第10天打開(kāi)腹腔檢查移植胚胎的植入情況。

2.小鼠胚胎著床點(diǎn)觀察：根據(jù)小鼠胚胎發(fā)育時(shí)程，在所需胚胎著床的時(shí)間尾靜脈注射0.4%臺(tái)盼藍(lán)，其后頸椎脫臼處死小鼠，從腹部打開(kāi)，取出完整的卵巢和子宮，進(jìn)行拍照。

六、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮主要由一圓柱型水池和一可移動(dòng)位置的站臺(tái)組成。水池高70 cm，直徑80 cm，站臺(tái)直徑8 cm，水池上空通過(guò)一個(gè)數(shù)字?jǐn)z相機(jī)與計(jì)算機(jī)相連接。預(yù)先在水池中注入清水，水深15 cm，加入炭素墨水使池水變?yōu)椴煌该鞯暮谏?，站臺(tái)表面為黑色，使小鼠不能看到，水面高出站臺(tái)表面0.5 cm。水溫控制在(22±0.5)℃，在水池上標(biāo)定相同一點(diǎn)作為每次實(shí)驗(yàn)小鼠的入水點(diǎn)。站臺(tái)置于離入水點(diǎn)較遠(yuǎn)的象限中間，實(shí)驗(yàn)過(guò)程保持站臺(tái)位置不變。每次實(shí)驗(yàn)以120 s為限，紀(jì)錄動(dòng)物從入水點(diǎn)到達(dá)站臺(tái)所需時(shí)間以及在這段時(shí)間內(nèi)的游泳路程和速度，以所需時(shí)間作為學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)，若設(shè)定時(shí)間內(nèi)未找到站臺(tái)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤，記錄時(shí)間為120 s。每次實(shí)驗(yàn)在隔音的房間內(nèi)進(jìn)行，水池、光源、鼠籠等實(shí)驗(yàn)室各物件的位置保持不變。經(jīng)3 d訓(xùn)練，若小鼠在120 s內(nèi)找到站臺(tái)，讓其在站臺(tái)上停留20 s，若小鼠未找到站臺(tái)，將其放在站臺(tái)上使其停留20 s。于第4天、第5天、第7天和第11天進(jìn)行4個(gè)階段的Morris水迷宮學(xué)習(xí)和測(cè)試。

七、小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

打開(kāi)DT-200小鼠跳臺(tái)測(cè)試箱，將參加實(shí)驗(yàn)的各組小鼠先放入反應(yīng)箱銅柵處自由活動(dòng)3 min，熟悉實(shí)驗(yàn)環(huán)境。然后通以32 V交流電，設(shè)置實(shí)驗(yàn)時(shí)間為5 min，小鼠受到電擊后將尋找跳臺(tái)以躲避電擊。實(shí)驗(yàn)時(shí)將實(shí)驗(yàn)鼠直接放上跳臺(tái)，記錄各組小鼠第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)和10 min內(nèi)從跳臺(tái)跳下的錯(cuò)誤次數(shù)(記作錯(cuò)誤次數(shù))。測(cè)驗(yàn)時(shí)若小鼠停留在平臺(tái)的時(shí)間超過(guò)10 min，其潛伏期以10 min計(jì)。連續(xù)訓(xùn)練4 d，每天1次。每次進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)時(shí)，要求試驗(yàn)環(huán)境，各種參照物保持一致，而且保持安靜、空氣清新及水溫恒定。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以(±s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、密閉培養(yǎng)對(duì)昆明小鼠胚胎發(fā)育與著床的影響

收集小鼠2-細(xì)胞胚胎，分成密閉培養(yǎng)組和對(duì)照組，分別體外培養(yǎng)至囊胚期以供移植。受體鼠每側(cè)子宮7～8個(gè)胚胎，胚胎移植后第10天解剖檢查胚胎植入情況。研究結(jié)果顯示，在密閉培養(yǎng)組(n=8)中共有6只小鼠受孕，受孕率為75%，對(duì)照組(n=7)中共有5只小鼠受孕，受孕率為71.43%，兩組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；對(duì)于囊胚植入情況，在密閉培養(yǎng)組中移植120個(gè)囊胚，囊胚植入率為59.17%，對(duì)照組中移植105個(gè)胚胎，囊胚植入率為57.14%，兩組間無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組培養(yǎng)方式對(duì)小鼠胚胎發(fā)育和著床的影響

另外，我們根據(jù)小鼠胚胎發(fā)育時(shí)程，在所需胚胎定位的時(shí)間尾靜脈注射臺(tái)盼藍(lán)，觀察移植胚胎著床數(shù)和著床點(diǎn)。結(jié)果顯示，密閉培養(yǎng)組胚胎著床數(shù)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖2)。以上結(jié)果提示，密閉培養(yǎng)體系中小鼠胚胎具有良好的發(fā)育潛能，該體系能夠支持小鼠早期胚胎在密閉培養(yǎng)條件下正常發(fā)育。

二、密閉培養(yǎng)的胚胎移植后對(duì)新生小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是學(xué)習(xí)與記憶研究的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)研究密閉培養(yǎng)胚胎移植后對(duì)新生小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響，結(jié)果顯示，密閉培養(yǎng)組第1～4階段水迷宮定位航行時(shí)間較對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表2)。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)也是檢測(cè)動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶能力的常用方法。本研究采用小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)研究密閉培養(yǎng)胚胎移植后對(duì)新生小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，密閉培養(yǎng)組的潛伏期與錯(cuò)誤次數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表3)。以上結(jié)果提示，密閉培養(yǎng)的胚胎移植后對(duì)新生小鼠學(xué)習(xí)能力沒(méi)有顯著影響。

A：對(duì)照組(左：陰性對(duì)照組；右：移植組)，B：密閉培養(yǎng)組(左：陰性對(duì)照組；右：移植組)圖2 小鼠胚胎移植著床點(diǎn)

組 別只數(shù)定位航行用時(shí)(s)第4天第5天第7天第11天對(duì)照組 2017.224±7.83116.534±8.23615.853±9.20113.936±7.279密閉培養(yǎng)組2018.673±5.83416.908±4.28415.936±5.38317.538±9.627

表3 新生小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x-±s)

討 論

在輔助生殖技術(shù)中，早期胚胎體外培養(yǎng)是IVF-ET的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。近年來(lái)，隨著早期胚胎體外培養(yǎng)體系的不斷改進(jìn)與完善，研究者們逐漸將目光集中在早期胚胎體外發(fā)育的培養(yǎng)環(huán)境上[6]。由于近年來(lái)大氣環(huán)境的污染，導(dǎo)致人類生育功能受到影響[3，7]。在IVF-ET中，早期胚胎培養(yǎng)過(guò)程中容易受到包括室內(nèi)外氣體變化及波動(dòng)的影響，因此室內(nèi)外及培養(yǎng)箱中的氣體質(zhì)量及穩(wěn)定性對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要，如何有效降低氣體對(duì)胚胎發(fā)育的影響也成了人們關(guān)注的熱點(diǎn)[8-9]。密閉培養(yǎng)系統(tǒng)是一個(gè)與外界環(huán)境隔離的培養(yǎng)系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)在于可有效避免外界環(huán)境波動(dòng)對(duì)胚胎的影響[10]。本研究通過(guò)在小鼠胚胎中探索密閉培養(yǎng)系統(tǒng)的可靠性及其對(duì)胚胎發(fā)育潛能的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，在密閉胚胎培養(yǎng)體系中培養(yǎng)的小鼠胚胎具有較好的受孕率(75.00%)和囊胚植入率(59.17%)，與正常對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。這提示在密閉培養(yǎng)體系中小鼠胚胎具有良好的發(fā)育潛能。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是1981年由英國(guó)心理學(xué)家Richard G Morris建立的，主要用于研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力[11-12]。此后，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)被不斷地完善和改進(jìn)，逐漸成為研究學(xué)習(xí)與記憶最常用的實(shí)驗(yàn)方法之一，目前已被廣泛應(yīng)用于和空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥劑學(xué)、行為生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科或領(lǐng)域的科學(xué)研究[13-14]。本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)研究密閉培養(yǎng)體系的胚胎移植后對(duì)新生小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，結(jié)果顯示，密閉培養(yǎng)組第1～4天水迷宮定位航行時(shí)間較對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05)，提示本密閉體系培養(yǎng)的胚胎移植后新生小鼠學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有受到明顯影響。小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)也是一種常用的評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的方法，能較客觀地反映動(dòng)物經(jīng)過(guò)一次刺激后記憶獲得的情況[15-16]。本研究通過(guò)小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)研究密閉培養(yǎng)胚胎移植后對(duì)新生小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，密閉培養(yǎng)組的潛伏期與錯(cuò)誤次數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

綜上所述，密閉培養(yǎng)體系培養(yǎng)的胚胎與常規(guī)培養(yǎng)得到的胚胎相比，在胚胎質(zhì)量和著床上并無(wú)明顯差異，且對(duì)其子代小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力也沒(méi)有明顯影響，提示胚胎密閉培養(yǎng)體系方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果安全可靠且成本較低，具有較大的發(fā)展?jié)摿?，值得進(jìn)一步的深入研究。