董麗丹，魏長平，李中田，汪鳳明

(1.長春理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130022;2.長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 長春 130031;3.中水東北勘測設(shè)計研究有限責(zé)任公司，吉林 長春130061)

1 引 言

止血是醫(yī)院各科室手術(shù)中的一個重要環(huán)節(jié)，對于手術(shù)的成功和患者的安危起著重大的作用。殼聚糖因具有抗菌、止血、促進(jìn)傷口愈合等性質(zhì)使其成為止血敷料的重要選擇[1-3]。近年來通過復(fù)合一些有止血消炎效果的藥物或離子來提高止血材料的止血效果成為當(dāng)前和未來止血敷料的發(fā)展趨勢[4-5]。Ong等人[6]將多磷酸鹽(前止血劑)作為止血劑佐劑，結(jié)合抗菌素對殼聚糖止血敷料進(jìn)行改進(jìn)，與殼聚糖相比，可加速凝血、促進(jìn)血小板粘附。

納米殼聚糖因其微粒尺寸的特殊性[6-7]，較殼聚糖具有更好的水溶性、生物可降解性，可促進(jìn)細(xì)胞生長，其止血作用較殼聚糖更加優(yōu)秀[8-9]。由于Ca2+具有凝血輔助作用，納米殼聚糖中加入Ca2+能增強(qiáng)止血效果[10-11]，Ag+能通過緩釋技術(shù)使微生物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞使微生物死亡達(dá)到抗菌效果[12-13]。納米殼聚糖復(fù)合止血輔助因子的止血研究尚未見諸文獻(xiàn)報道。本文將殼聚糖分子納米化，制得納米殼聚糖，再與硝酸銀和氯化鈣溶液充分反應(yīng)，得到納米殼聚糖復(fù)合止血材料。采用 FTIR、XRD、SEM等手段表征其結(jié)構(gòu)并考察其凝血、止血性能。初步證明納米殼聚糖絡(luò)合了Ag+和Ca2+生產(chǎn)了新的復(fù)合物，且較納米殼聚糖具有良好的止血性。

2 材料與制備

2.1 材料與儀器

殼聚糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、硝酸銀(北京化工廠)、冰乙酸(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、二水合氯化鈣(阿拉丁化工廠)、過氧化氫(河北建寧藥業(yè)有限公司)、恒溫水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)。昆明鼠(生物實(shí)驗(yàn)用)。

2.2 樣品制備

納米殼聚糖：稱取2.0 g殼聚糖向其中加入2%的冰乙酸溶液至完全溶解，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H2O2溶液繼續(xù)反應(yīng)2 h后向其中加入三聚磷酸鈉溶液，反應(yīng)，直至分散液出現(xiàn)乳光狀態(tài)，制得納米殼聚糖溶液放入鼓風(fēng)干燥箱中干燥，研磨成粉。

納米殼聚糖銀止血粉：稱取一定量納米殼聚糖溶入1%乙酸溶液中，再加入0.10 mol/L 的AgNO3溶液，加熱攪拌2 h。放入鼓風(fēng)干燥箱中干燥，研磨成粉。

納米殼聚糖鈣止血粉：稱取一定量納米殼聚糖溶入1%乙酸溶液中，再加入飽和CaCl2溶液加熱攪拌2 h，烘干，研磨成粉。

納米殼聚糖銀-鈣復(fù)合材料：稱取一定量納米殼聚糖溶入1%乙酸溶液中，加入0.10 mol/L的AgNO3溶液充分反應(yīng)，再向其中加入飽和CaCl2溶液加熱攪拌2 h，烘干，得到成品。

3 樣品表征及性能測試

紅外光譜(FT-IR)：在傅里葉變換紅外光譜儀上，使用KRS-5型ATR探頭，用反射法在500～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描[14]，并記錄各樣品的紅外光譜。

射線衍射光譜(XRD)：室溫下使用Rigaku D/MAX-RB型X射線衍射儀記錄樣品的X射線衍射圖譜。X射線源為Cu-Kα線，電壓為40 kV，電流為50 mA，DS/SS為0.5，掃描角度10°～80°，掃描速度為10°/min。

掃描電鏡(SEM)：為了更好觀察混合金屬離子，所以將樣品鋪成膜。用Quanta-200掃描電鏡觀察膜表面。

樣品的凝血、止血性能測試：為了測試實(shí)驗(yàn)樣品的凝血和止血性能，本文建立了動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，選用成年雄性昆明鼠體重在18～26 g之間，進(jìn)行樣品的體外凝血和止血實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)果與討論

4.1 樣品結(jié)構(gòu)測試分析

4.1.1 樣品的紅外光譜分析

CS和nmCS的紅外光譜如圖1所示：CS與TPP 作用后，3 423 cm-1處的O-H伸縮振動吸收峰移至3 429 cm-1處，向高波數(shù)偏移，表明形成了較強(qiáng)的分子內(nèi)和分子間氫鍵；1 652 cm-1處尖峰消失，1 647 cm-1出現(xiàn)了尖峰，并且1 96 cm-1的吸收峰向低處偏移36 cm-1，這一結(jié)果與TPP交聯(lián)的殼聚糖納米粒子和經(jīng)磷酸鹽修飾后的殼聚糖的結(jié)果相似，說明磷酸鹽已經(jīng)連接到了氨基位點(diǎn)上；殼聚糖的1 261 cm-1處的游離羥基峰在納米殼聚糖中變?nèi)?，這說明游離的羥基峰在納米粒子中形成了分子間氫鍵。此外，在1 344～1 097 cm-1處出現(xiàn)了一系列峰，這是由于P-O鍵的伸縮振動吸收引起的；在1 000～850 cm-1處出現(xiàn)峰是由于P-O鍵彎曲振動吸收引起的，表明生成了納米殼聚糖。反應(yīng)如下：

Chitosan-NH2+RCOOH—Chitosan-NH+3+RCOO-

圖1 CS和nmCS的紅外光譜圖 Fig.1 FT-IR spectra of chitosan(a) and nm chitosan(b)

nmCS復(fù)合Ag+、Ca2+紅外光譜如圖2所示。

圖2 nmCS復(fù)合Ag+、Ca2+的紅外光譜圖 Fig.2 FT-IR spectra of nm Chitosan composite Ag+, Ca2+

(1)nmCS復(fù)合Ag+后:①nmCS羥基的伸縮振動吸收寬峰發(fā)生了波數(shù)移動，吸收峰由原來的3 429 cm-1變?yōu)? 419 cm-1，表明O-H與Ag+產(chǎn)生了較強(qiáng)的氫鍵作用；②殼聚糖吡喃環(huán)上的醚鍵伸縮振動吸收峰向低處偏移，吸收峰由原來的1 097 cm-1變?yōu)? 074 cm-1。表明Ag+與吡喃環(huán)上的醚鍵發(fā)生了相互作用。

(2)nmCS復(fù)合Ca2+后:①-NH2、-CH3伸縮振動峰發(fā)生了移動，吸收峰由原來的1 409 cm-1變?yōu)? 454 cm-1，表明-NH2、-CH3與Ca2+產(chǎn)生了較強(qiáng)的氫鍵作用；②殼聚糖吡喃環(huán)上的醚鍵伸縮振動吸收峰向低處偏移，吸收峰由1 097 cm-1變?yōu)? 074 cm-1。表明Ca2+與吡喃環(huán)上的醚鍵發(fā)生了相互作用。

4.1.2 樣品的射線衍射分析

CS和nmCS的XRD如圖3所示：殼聚糖降解前的特征峰為19.48，降解后的特征峰為21.92，峰位置變化不大，說明降解前后殼聚糖的基本結(jié)晶結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。但降解后殼聚糖的衍射強(qiáng)度略有下降，說明降解后殼聚糖的結(jié)晶度有所降低。

圖3 CS和nmCS的XRD圖 Fig.3 XRD spectra of chitosan(a) and nm chitosan(b)

圖4 nmCS復(fù)合Ag+、Ca2+的XRD圖 Fig.4 XRD spectra of nm Chitosan composite Ag+, Ca2+

nmCS復(fù)合Ag+、Ca2+的XRD如圖4所示：nmCS只在2θ=21.92°處出現(xiàn)衍射吸收峰，單質(zhì)銀的特征峰2θ=38.2°、44.4°、64.6°、77.6°。當(dāng)nmCS復(fù)合Ag+時2θ=23.84°、32.32°、46.28°、55.12°、76.4°處出現(xiàn)吸收峰，nmCS和單質(zhì)銀的特征吸收峰均發(fā)生了偏移，表明Ag+經(jīng)分子間的氫鍵作用合成了納米CS-Ag，當(dāng)nmCS復(fù)合Ca2+時其在2θ=27.24°、31.52°、45.24°、56.48°、66.28°、75.24°處出現(xiàn)衍射峰，該結(jié)果表明，nmCS復(fù)合了Ca2+合成了新物質(zhì)nmCS-Ca。

4.1.3 樣品的掃描電鏡分析

納米殼聚糖、Ca-納米殼聚糖和銀-納米殼聚糖的掃描電鏡圖分別由由圖5(a)、5(b)、5(c)所示，納米殼聚糖顆粒成球狀，粒徑約為80 nm，發(fā)生粘連。

圖5 nmCS、Ca-nmCS及Ag-nmCS掃描電鏡圖 Fig.5 SEM micrographs of nm Chitosan composite Ag+、Ca2+

通過圖5可以看出，nmCS-Ag的掃描電鏡中有些許的析出，原因是硝酸銀本身性質(zhì)的不穩(wěn)定，見光易分解析出單質(zhì)銀。nmCS-Ca的掃描圖片顯示nmCS和Ca2+的復(fù)合很好，基本沒有析出。

4.2 樣品性能測試分析

4.2.1 凝血測試分析

樣品的凝血性能測試方法：向每個試管中加入1 mL 0.10 mol/L草酸鉀溶液作為抗凝劑備用。從小白鼠靜脈取血5 mL放入試管中后按每毫升血液加入0.2 g樣品粉末，每個樣品測試3組平行數(shù)據(jù)，取平均值。每隔數(shù)秒傾斜試管，發(fā)現(xiàn)血液凝集立即記錄時間，結(jié)果見表1。

由此可見，Ag-Ca-nmCS的凝血效果要優(yōu)于Ag-nmCS和Ca-nmCS，其中Ca-nmCS的凝血效果要優(yōu)于Ag-nmCS，同時Ag-nmCS和Ca-nmCS的凝血效果要好于CS和nmCS的凝血效果。

表1 樣品的凝血時間測試Tab.1 Clotting time test of the sample

4.2.2 止血測試分析

樣品的止血性能測試方法：將小鼠放進(jìn)離心管中使其頭部固定，于尾尖5 cm處切斷，制造出血創(chuàng)面?？瞻讓φ諏?shí)驗(yàn)將尾尖在自然狀態(tài)下止血，從切斷尾尖開始，到不再有血滴滲出，記錄止血時間，分別測試3組平行數(shù)據(jù)，計算平均值；另外5組樣品，在切斷小鼠尾尖后，取0.2 g樣品均勻涂抹于傷口，使尾部保持自然狀態(tài)不動，使傷口與樣品始終接觸，從切斷尾尖開始，直到不再出血為止，記錄止血時間，5個樣品分別測試三組平行數(shù)據(jù)，計算平均值(表2)。

從平均止血時間來看，Ag-Ca-nmCS的止血效果要優(yōu)于Ag-nmCS和Ca-nmCS，其中Ca-nmCS的止血效果要優(yōu)于Ag-nmCS同時Ag-nmCS和Ca-nmCS的止血效果要好于CS和nmCS的止血效果。

表2 樣品的止血時間測試Tab.2 Bleeding time test of the sample

5 結(jié) 論

(1)殼聚糖經(jīng)納米化制得納米殼聚糖向其中加入Ag+和Ca2+制得納米殼聚糖復(fù)合止血材料。

(2)對樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)和性能表征，研究發(fā)現(xiàn)：加入了Ag+和Ca2+的納米殼聚糖其IR圖譜顯示在1 647 cm-1和1 560 cm-1處出現(xiàn)了納米殼聚糖鈉鹽的特征吸收峰，XRD圖譜表現(xiàn)出相應(yīng)晶型，以上說明Ag+和Ca2+成功與納米殼聚糖復(fù)合。SEM圖像可以看出Ca-nmCS的復(fù)合效果好于Ag-nmCS。

(3)添加了Ag+和Ca2+的納米殼聚糖可以有效地縮短凝血和止血時間，其中分別單獨(dú)添加Ag+和Ca2+制備出的止血粉相比，添加Ca2+制備的止血粉其止血效果要稍好于添加Ag+制備的止血粉。同時添加Ag+和Ca2+制備的止血粉，在復(fù)合效應(yīng)作用下獲得了更優(yōu)的凝血和止血性能。