王佳燕 吳優(yōu)楠 應(yīng)凱燕 陸 胤

（浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院 浙江杭州 310015）

引言

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和電子產(chǎn)品的不斷普及，電子廢棄物的數(shù)量與日俱增，成為全球增長(zhǎng)速度最快的固體廢棄物[1]而我國(guó)的電子垃圾總產(chǎn)量從2010年的230萬(wàn)t亦是激增加到2015年的860萬(wàn)t[2]。電子產(chǎn)品在制造過(guò)程中需要加入大量的鉛、汞、鎘、鉻等有害物質(zhì)[3]，而電子產(chǎn)品廢棄后未經(jīng)處理或不當(dāng)處理導(dǎo)致其有害物質(zhì)進(jìn)入水體，致使細(xì)菌數(shù)、重金屬含量等污染指標(biāo)都嚴(yán)重超標(biāo)[4]，并最終對(duì)人類(lèi)生活和健康造成嚴(yán)重的危害[5]。浙江臺(tái)州就是我國(guó)兩大電子廢棄物拆遷基地之一，也是長(zhǎng)江三角洲最大的電子垃圾聚集地。位處臺(tái)州的椒江水系作為浙江八大水系之一、臺(tái)州人民的母親河，水體污染日益嚴(yán)重，從七八十年代的漁業(yè)為生，到現(xiàn)在的魚(yú)蝦罕見(jiàn)，環(huán)境治理刻不容緩。本文選取浙江省電子污染高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)臺(tái)州地區(qū)椒江水系的5個(gè)典型斷面水域?yàn)檠芯繉?duì)象，從理化因子、急性毒性及遺傳毒性來(lái)綜合評(píng)價(jià)水體的污染情況。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 采樣位點(diǎn)的布設(shè)

在污染調(diào)查的基礎(chǔ)上，根據(jù)電子廢棄物拆解場(chǎng)所的分布，結(jié)合水域特征，并參照環(huán)保部門(mén)的檢測(cè)站位，從椒江水系支流匯合點(diǎn)（臨海市西郊三江村）至出海口（牛頭頸）選取5個(gè)斷面（三江村、臨海大橋、釣魚(yú)亭、三江口、牛頭頸）進(jìn)行取樣（圖1）。各斷面功能分別為：1）三江村斷面為對(duì)照斷面，位于支流匯合處，反映椒江水系主干流的初始狀況；2）臨海大橋、釣魚(yú)亭、三江口為控制斷面，用于評(píng)價(jià)水域兩岸污染源對(duì)水質(zhì)的影響；3）牛頭頸為削減斷面，位處椒江水系入?？冢从撑_(tái)州段污染物稀釋凈化的情況。采樣時(shí)間為2017年7月，采樣深度為表層水下30~50 cm，每個(gè)樣點(diǎn)重復(fù)隨機(jī)取樣3次，并記錄水溫、pH值等。

圖1 臺(tái)州椒江水系采樣位點(diǎn)示意圖

1.2 水質(zhì)理化指標(biāo)的測(cè)定

按國(guó)標(biāo)法對(duì)采集的各個(gè)斷面水樣進(jìn)行溶解氧（DO）（HJ506-2009）、化學(xué)需氧量（CODCr）（GB/T11892-1989）、五日生化需氧量（BOD5）（HJ505-2009）、總氮（TN）（GB/T11894-1989）、總磷（TP）（GB/T11893-1989）、重金屬含量等項(xiàng)目的測(cè)試。

1.3 鹵蟲(chóng)急性毒性試驗(yàn)

依據(jù)已建模的鹵蟲(chóng)急性毒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)[6]，選取鹵蟲(chóng)優(yōu)良卵體曝光2×24 h，在人工海水中孵化。以預(yù)實(shí)驗(yàn)所得的濃度，將5個(gè)樣點(diǎn)的水樣分設(shè)7個(gè)濃度梯度（水樣濃縮），每個(gè)濃度5個(gè)重復(fù)。取10只活力良好的Ⅱ~Ⅲ期鹵蟲(chóng)，暴露于各水樣24 h后，置于雙目鏡前觀察，以鹵蟲(chóng)幼體在10 s內(nèi)無(wú)游動(dòng)作為死亡的標(biāo)志，記錄存活個(gè)數(shù)，按下述公式計(jì)算校正死亡率，并利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)LC50值（校正死亡率為50%時(shí)的水樣濃縮倍數(shù)）及其95%置信區(qū)間。

1.4 遺傳毒性評(píng)價(jià)

1.4.1 DNA損傷檢測(cè)

進(jìn)一步選取典型污染水樣，將10條相似體長(zhǎng)及活性（每分鐘運(yùn)動(dòng)）的鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體在污染水樣中飼毒24h，而后用液氮將鹵蟲(chóng)研磨成粉末狀，DNA試劑盒提取鹵蟲(chóng)DNA，凍存?zhèn)溆谩?%瓊脂糖凝膠制備取0.25 g瓊脂糖加入25 mL TAB1×溶液，沸騰三次，搖勻無(wú)氣泡，冷卻后加入2 mL EB，倒入水平制膠板；上樣鹵蟲(chóng)DNA并加1mL溴酚藍(lán)指示劑/每樣，含Loading Buffer 10×；TAB1×緩沖液電泳，電壓U=85~125 V，電流I=100~300mA，30~40min；紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4.2 SCGE檢測(cè)和膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI檢測(cè)

同上述方法獲得飼毒鹵蟲(chóng)，每組10個(gè)重復(fù)；對(duì)照組則暴露于1%DMSO的人工海水溶液（v/v）中。獲得鹵蟲(chóng)體腔細(xì)胞后[7]，用5%乙醇、95%生理鹽水、2.5 mg/mL的EDTA、10 mg/mL的愈創(chuàng)木酚甘油醚（pH 7.3）沖洗，離心（9000 r/min，4 °C）后凍存。彗星試驗(yàn)前，用磷酸鹽緩沖液（PBS）冰浴沖洗細(xì)胞。而后用膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，通過(guò)FACSort流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，美國(guó)）在凋亡細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸定量檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用雙向方差分析（方差分析）和事后檢驗(yàn)，p＜0.05在處理組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SPSS 17和Origin 8軟件作為工具來(lái)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖形。采用PCA分析中的R語(yǔ)言Vegan軟件包進(jìn)行典型對(duì)應(yīng)分析，通過(guò)rda()和summary()函數(shù)獲得詳細(xì)的排序結(jié)果，通過(guò)biplot()函數(shù)生成排序圖[8]，綜合評(píng)價(jià)電子廢棄物污染與鹵蟲(chóng)水生毒性的相關(guān)性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果分析

2.1.1 水質(zhì)理化數(shù)據(jù)測(cè)定

5個(gè)典型斷面水質(zhì)的理化指標(biāo)見(jiàn)表1。從pH值來(lái)看，5個(gè)樣點(diǎn)中釣魚(yú)亭與三江口水樣略偏酸性，而其余三個(gè)樣點(diǎn)呈弱堿性。由于采樣時(shí)間不同，各樣點(diǎn)的水溫值存在一定差異，這與采樣當(dāng)天的天氣密切相關(guān)，除三江口外，其它各樣點(diǎn)的水溫相差較小?？偟獮獒烎~(yú)亭最高，三江村最低，這與其周邊環(huán)境有較大關(guān)系。重金屬含量以三江口與牛頭頸最高，三江村與釣魚(yú)亭含量相對(duì)較少。

表1 各斷面水樣理化數(shù)據(jù)

2.1.2 鹵蟲(chóng)急性毒性分析

LC50表示殺死50%實(shí)驗(yàn)生物的藥劑濃度。在本試驗(yàn)中，LC50表示鹵蟲(chóng)死亡率達(dá)到50%時(shí)對(duì)應(yīng)水樣的濃縮倍數(shù)，水樣的濃縮倍數(shù)越高，水樣的毒性也越小，污染程度也越小。經(jīng)孵育、飼毒，5個(gè)斷面的水體毒性為：三江口＞牛頭頸＞臨海大橋＞三江村＞釣魚(yú)亭（表2）。為進(jìn)一步探究分析電子廢棄物的水生毒性，我們選取死亡率最大的兩個(gè)典型污染斷面水樣（三江口和牛頭頸）進(jìn)行而后的遺傳毒性評(píng)價(jià)。

2.1.3 鹵蟲(chóng)遺傳毒性分析

兩個(gè)典型污染斷面水樣（三江口和牛頭頸，選取LC50濃縮倍數(shù)）處理后鹵蟲(chóng)DNA損傷的瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖2。電泳圖譜表明，降解的DNA遷移距離最遠(yuǎn)，在泳道最末端；DNA片斷越大，遷移距離越小，距離點(diǎn)樣孔越近，未斷裂DNA在點(diǎn)樣孔處遷移距離非常?。籇NA片斷越小，遷移距離越大，距離點(diǎn)樣孔越遠(yuǎn)。2、3號(hào)泳道和1號(hào)空白組泳道相比，很清晰的表明了鹵蟲(chóng)DNA受到了不同的程度的斷裂。結(jié)合鹵蟲(chóng)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，三江口水樣污染毒性教牛頭頸水樣大，且隨著水樣污染程度的逐漸升高，DNA的遷移距離逐漸變大，DNA的斷裂碎片逐漸變小，斷裂程度相對(duì)變大。一定程度上表明了鹵蟲(chóng)DNA的損傷程度與水樣污染程度成一定的效應(yīng)關(guān)系，即水樣污染程度越嚴(yán)重，鹵蟲(chóng)為進(jìn)一步探究鹵蟲(chóng)DNA損傷的主要緣由，我們將鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體體腔細(xì)胞在上述水樣暴露下進(jìn)行DNA損傷彗星圖像分析。許多研究表明，活性氧是DNA損傷的主要來(lái)源?；钚匝跻鸬腄NA損傷引起鏈斷裂，移除核苷酸和修改核苷酸堿基[9]。圖3顯示了牛頭頸和三江口濃縮水樣暴露下鹵蟲(chóng)體腔細(xì)胞的典型DNA損傷彗星圖像，表明兩個(gè)水域的水體可能導(dǎo)致活性氧的積累而引起隨后的DNA損傷。

表2 各斷面水樣LC50值

圖2 DNA損傷程度的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 典型的DNA損傷彗星圖像

為明確鹵蟲(chóng)DNA損傷情況，進(jìn)一步的，采用流式細(xì)胞儀分析了鹵蟲(chóng)體腔細(xì)胞在上述水樣處理下細(xì)胞凋亡的情況。因磷脂酰絲氨酸從血漿細(xì)胞膜內(nèi)葉易位到細(xì)胞表面是發(fā)生在細(xì)胞凋亡早期的顯著特征[10]，故細(xì)胞凋亡將首先通過(guò)annexin-V-FITC結(jié)合標(biāo)記在細(xì)胞膜的外葉進(jìn)行磷脂酰絲氨酸表達(dá)膜變的損害，致使PI得以插層到細(xì)胞的DNA和RNA。結(jié)果表明，濃縮水樣處理24小時(shí)后凋亡率均顯著增加，分別為p＜0.05和p＜0.001。圖4中非處理細(xì)胞的凋亡率為4.3%。在濃縮水樣處理24 h后，細(xì)胞凋亡率分別達(dá)到22.3%（牛頭頸）和45.8%（三江口），分別5倍和10倍于基線水平的凋亡率，說(shuō)明這些細(xì)胞是在細(xì)胞膜的外葉進(jìn)行磷脂酰絲氨酸表達(dá)，呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增加后，通過(guò)細(xì)胞線粒體酶復(fù)合體鏈出現(xiàn)氧自由基的病理性增加（主要是H2O2，由O2·-歧化線粒體產(chǎn)生）[11]。另外，污染水體可作為DNA加合物和/或DNA交聯(lián)從而直接產(chǎn)生遺傳毒性的影響。

圖4 鹵蟲(chóng)體腔細(xì)胞在濃縮水樣暴露下的流式細(xì)胞儀分析

2.2 相關(guān)性分析

為更好了解不同水域水質(zhì)與環(huán)境因子間的關(guān)系，對(duì)相應(yīng)的環(huán)境因子應(yīng)用PCA分析中的R語(yǔ)言Vegan法進(jìn)行排序得到矩陣。表3數(shù)據(jù)表明，在CCA排序圖中，與第一軸關(guān)系最大的是LC50，其次分別為T(mén)N值、TP值和pH值，最小的是水溫；與第二軸關(guān)系最大的是TN值，其次分別是DO值、BOD值和水溫，與第二軸關(guān)系最小的環(huán)境因子則是COD值。上述結(jié)果說(shuō)明這些理化因子均對(duì)水質(zhì)具有明顯影響。其中，在現(xiàn)有因素中，對(duì)水質(zhì)影響最大的是TN值。

表3 環(huán)境因子與CCA排序軸間的相關(guān)系數(shù)

應(yīng)用CCA對(duì)5個(gè)典型斷面水體的環(huán)境因子及鹵蟲(chóng)急性毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行排序，樣點(diǎn)排序結(jié)果將5個(gè)斷面區(qū)分為4組如圖5。組1：釣魚(yú)亭位于第一個(gè)象限，其特征是DO、TN值較高；三江口位于第二象限，其特征是水溫及BOD值較高；牛頭頸位于第三象限，主要特征為COD值較高；三江村和臨海大橋位于第四象限，其特征是pH值、TP值及LC50值均較高?？梢?jiàn)，環(huán)境因子和水生毒性間有一定相關(guān)性。

圖5 五個(gè)典型斷面鹵蟲(chóng)急性毒性與環(huán)境因子間CCA排序圖

結(jié)語(yǔ)

電子廢棄物的成分相對(duì)復(fù)雜，目前認(rèn)為最主要的是混合了多種無(wú)法降解的有毒物質(zhì)重金屬，對(duì)電子廢棄物拆解、焚燒、和酸解的過(guò)程中產(chǎn)生的殘?jiān)蛷U水，可能通過(guò)下滲過(guò)程和地表徑流造成地下水的污染，致使重金屬擴(kuò)散。例如銅（Cu），汞（Hg），鋅（Zn），鎘（Cd），鎳（Ni），鉛（Pb），鐵（Fe）和錳（Mn）等又是對(duì)環(huán)境造成巨大危害的重金屬典型，所以我們?cè)谒畼又袡z測(cè)了這幾種重金屬，發(fā)現(xiàn)重金屬含量和毒性數(shù)據(jù)呈一定相關(guān)性，說(shuō)明鹵蟲(chóng)的水生毒性與水域中電子廢棄物含量有關(guān)。

通過(guò)對(duì)臺(tái)州椒江水系5個(gè)典型斷面的研究，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有的環(huán)境因子中，對(duì)水質(zhì)影響最大的是TN值。雖然水生毒性的不同評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)和方法結(jié)果有所差異，但較相近的，鹵蟲(chóng)的急性毒性和遺傳毒性分別從個(gè)體水平、分子水平表明三江村、釣魚(yú)亭和臨海大橋相對(duì)污染程度較輕，三江口和牛頭頸污染程度較高，其中又以三江口污染最為嚴(yán)重。據(jù)已有報(bào)道，我們推測(cè)電子廢棄物的污染可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的增加，且通過(guò)細(xì)胞線粒體酶復(fù)合體鏈出現(xiàn)氧自由基的病理性增加活性氧的積累，損傷DNA乃至細(xì)胞凋亡，最終呈現(xiàn)急性毒性。當(dāng)然，具體哪些重金屬造成鹵蟲(chóng)的水生毒性，如何用毒理數(shù)據(jù)直接表征電子廢棄物對(duì)水體環(huán)境的污染程度還有待進(jìn)一步研究。