田 晴 李 敏 吳鳳芝

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

植物多樣性的降低是引起地上部生態(tài)群落組成發(fā)生重大變化的主要原因，因為植物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中主要的生產(chǎn)者（Liesje et al.，2010）。Cardinale等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，多種植物在共同生長時產(chǎn)生的地上生物量比單一栽培植物要多。生物多樣性的下降可能會對與生物量、營養(yǎng)循環(huán)和分解相關(guān)的生態(tài)系統(tǒng)功能產(chǎn)生明顯的負面影響（Cardinale et al.，2012）。然而，為了追求作物高產(chǎn)與利益的最大化，現(xiàn)代集約化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中往往以單作栽培模式為主，這就導(dǎo)致了農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性的下降（Cook et al.，2006）。

填閑是可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要管理措施（Kabir & Koide，2002；Weil & Kremen，2007；Njeru et al.，2014），也可看作短期輪作（Schipanski et al.，2014；Gao et al.，2017）。填閑作物可以用作綠肥、生活覆蓋物和生物熏蒸作物；能夠減少土壤氮素的流失、控制雜草和土傳病原體（Wiggins &Kinkel，2005）；增加土壤微生物活性，改變土壤細菌群落和真菌群落的動態(tài)（Nair & Ngouajio，2012）。有研究表明，填閑后根系分泌物和枯枝落葉腐解釋放的次生代謝產(chǎn)物、微生物生物量、種群和多樣性的增加可以促進植物的生長（Guo et al.，2008；du Fall & Solomon，2011；Tian et al.，2011），吸引有益微生物或抑制植物病原微生物（Manici et al.，2004）。

以小麥作為填閑作物可以增加土壤肥力、控制雜草和病蟲害，還可以增加作物產(chǎn)量（Snapp et al.，2005；Schipanski et al.，2014）。將芥菜、蕎麥及普通白菜等填閑作物翻入土中可以有效地抑制土傳病害的發(fā)生（Wiggins & Kinkel，2005）。蔥蒜類蔬菜的根系分泌物可以對多種真菌和細菌產(chǎn)生直接的影響（Tsao & Yin，2001），抑制黃瓜致病鐮刀菌的繁殖（Li et al.，2016）。填閑小麥的黃瓜株高、地上部干質(zhì)量和產(chǎn)量低于填閑大蔥和普通白菜（李敏，2015），然而這3種作物填閑處理的微生物是如何變化的至今尚不清楚。本試驗采用高通量測序的方法，對部分16S rRNA基因和真菌ITS基因進行了測序，比較3種填閑模式的黃瓜根際土壤中細菌群落和真菌群落結(jié)構(gòu)，研究填閑小麥、大蔥和普通白菜對土壤微生物群落的影響，旨在了解不同填閑模式下的土壤生物成分，為黃瓜連作土壤填閑管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年1～12月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施工程中心節(jié)能日光溫室和園藝園林學(xué)院蔬菜生理生態(tài)研究室進行（45°41′N，126°37′E）。供試黃瓜（Cucumis sativus L.）品種為貞德F1，由遼西蔬菜研究所提供；小麥（Triticum aestivum L.）品種為品資Ⅱ-5，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；大蔥（Allium fistulosum）品種為雞腿蔥，購于深圳市飛度時代網(wǎng)絡(luò)公司；普通白菜（Brassica campestris L.）品種為華束高檔青梗菜，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院蔬菜生理生態(tài)研究室提供。

供試土壤為連作3 a黃瓜的日光溫室0～15 cm土層土壤，質(zhì)地為沙壤黑土，采用鮑士旦（2005）的方法測定土壤理化性質(zhì)：有機質(zhì)含量24.60 g·kg-1，速效鉀 352.19 mg·kg-1，有效磷 380.64 mg·kg-1， 堿 解 氮 156.45 mg·kg-1， 電 導(dǎo) 率 0.88 mS·cm-1（土水比為1∶2.5），pH值6.57（土水比為 1∶2.5）。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采取盆栽方式進行，將供試土壤與化肥混合均勻后裝入塑料桶（直徑25 cm、深35 cm）中，每桶10 kg（含磷酸二銨、硫酸鉀各25 g）；塑料桶埋入土中以降低環(huán)境影響。根據(jù)填閑季節(jié)和作物的不同設(shè)置3個處理（表1）。冬季填閑大蔥為秋季貯存的雞腿蔥，每桶7株；普通白菜每桶播種50粒，均勻間苗后統(tǒng)一留苗30株；夏季填閑小麥，每桶播種120粒，出苗后統(tǒng)一留苗100株，待小麥長到20 cm時留茬2 cm收割，割下的部分放回原桶，1個月后將曬干的地上部植株和殘茬翻入土中。黃瓜常規(guī)育苗，3月進行春茬定植，6月下旬拉秧整地；9月初進行秋茬定植，12月中下旬拉秧整地。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)6桶，隨機排列，小區(qū)周圍設(shè)置保護行，常規(guī)管理。

表1 試驗處理及編號

1.3 試驗方法

1.3.1 土樣采集 分別在春茬（6月21日）和秋茬（12月22日）黃瓜拉秧前取土樣。各處理隨機收集黃瓜根際土壤，將植株從土壤中拔出并從根部抖落土壤（Constantin et al.，2010），過20目篩后于-70℃冰箱中保存，用于土壤細菌群落和真菌群落的結(jié)構(gòu)多樣性分析。

1.3.2 土壤總DNA的提取 根據(jù)制造商的使用說明書，使用 Power Soil?DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories，CA，USA）從0.25 g根際土壤中提取土壤DNA。對每個土壤樣品一式3份提取，然后將提取的溶液混合作為1次重復(fù)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的土壤DNA。使用Nano Drop ND-1000 UV-Vis分光光度計（Thermo Scientific，Rockwood，TN，USA）檢測提取物的DNA濃度和質(zhì)量（A260/A280）。

1.4 高通量測序

采用Illumina MiSeq測序分析土壤細菌群落和真菌群落的組成。分別用引物515F/907R（許穎等，2016）和ITS1F/2043R（Yang et al.，2016）擴增細菌16S rRNA基因的V3～V5區(qū)域和真菌ITS基因。合并擴增產(chǎn)物并在2%瓊脂糖凝膠（TBE緩沖液）上評估，在Illumina MiSeq Genome Sequome PE300 Titanium平臺（Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.，Shanghai，China）上進行測序。

1.5 序列分析

使用Mothur軟件處理獲得的DNA序列（Schloss et al.，2009）。首先去除短于 200 bp以及平均質(zhì)量分數(shù)低于20的序列，再通過Uchime algorithm軟件去除嵌合體序列信息，得到優(yōu)質(zhì)序列（Edgar，2010）。將篩選得到的優(yōu)質(zhì)序列使用 CD-HIT（Cluster Database at High Identity with Tolerance）基于97%相似度水平進行OTU聚類（Li & Godzik，2006）。使用含有細菌和真菌核糖體RNA序列（版本119）的SILVA（細菌）and Unite（真菌）數(shù)據(jù)庫（Pruesse et al.，2007）對序列進行分類。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗原始數(shù)據(jù)的整理采用Microsoft Excel（Office 2016）軟件完成，Illumina MiSeq測序數(shù)據(jù)使用 R（v3.4.4）（http：//www.Rproject.org/）計算Coverage、Evenness、Chao1、Shannon 和 Simpson 多樣性指數(shù)。使用Origin 8.5軟件做圖。主成分分析（PCA）運用Canoco for Windows 4.5軟件進行（Wang et al.，2009）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同作物填閑對土壤細菌群落和真菌群落多樣性的影響

由表2可知，對獲得的高通量原始數(shù)據(jù)進行整理、去噪和去除嵌合體和非細菌序列后，3個處理共產(chǎn)生了137 147個優(yōu)質(zhì)的細菌序列和180 768個真菌的有效序列。在每個細菌群落和真菌群落的截止水平為3%時，各處理的覆蓋率均高于99%，表明具有足夠的測序深度。在真菌群落中，填閑普通白菜處理的OTU數(shù)量顯著高于填閑小麥；填閑普通白菜處理的香農(nóng)指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著高于填閑大蔥和小麥。

2.2 不同作物填閑對土壤微生物群落多樣性的影響

3種填閑模式處理的土壤細菌群落和真菌群落中的主要物種基本一致，但是相對豐度存在差異（圖1～8）。本試驗將土壤微生物群落中＜1%的種群都劃分到其他分類中。

表2 不同作物填閑處理對土壤細菌群落和真菌群落豐度和多樣性指數(shù)的影響

2.2.1 不同作物填閑對細菌門和綱水平的影響 在土壤細菌群落中觀察到36個門，Proteobacteria（38.68%～39.45%）、Acidobacteria（10.50%～11.57%）、Actinobacteria（9.59%～10.34%）、Bacteroidetes（9.00%～10.69%）、Chloroflexi（6.25%～7.80%）、Gemmatimonadetes（4.42%～5.30%）、Planctomycetes（4.67%～5.16%） 和 Firmicutes（4.50%～6.13%）是主要的門類，占土壤細菌菌群豐度的91%以上（圖1）。在細菌綱水平上，填閑大蔥處理中 Gammaproteobacteria、Bacilli、Chloroplast和Phycisphaerae的相對豐度較低，Gemmatimonadetes的相對豐度較高；填閑小麥處理中Acidobacteria、Cytophagia、Deltaproteobacteria、Thermoleophilia、Anaerolineae、Nitrospira和Acidimicrobiia的相對豐度較低，Clostridia、Flavobacteria和Chloroplast的相對豐度較高；填閑普通白菜處理中Sphingobacteriia的相對豐度較低，而JL-ETNP-Z39_norank的相對豐度較高（圖2）。

圖1 3種填閑作物對土壤中細菌主要門群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.2 不同作物填閑對細菌目和屬水平的影響 在細菌目水平上，填閑小麥處理中Cytophagales和Myxococcales的相對豐度顯著低于填閑大蔥和普通白菜；而Clostridiales和Flavobacteriales的相對豐度顯著高于填閑大蔥和普通白菜。填閑大蔥處理中Nitrosomonadales和Subgroup_6的相對豐度顯著高于填閑小麥，Gemmatimonadales的相對豐度顯著高于填閑小麥和普通白菜（圖3）。在細菌屬水平上，填閑小麥處理中Flexibacter、Nitrosomonadaceae_uncultured和Anaerolineaceae_unculture的相對豐度顯著低于填閑大蔥和普通 白 菜， 而 Flavobacterium、Clostridium和Peptostreptococcaceae_incertae_sedis的相對豐度顯著高于填閑大蔥和普通白菜；填閑普通白菜處理中Chloroplast_norank和Dokdonella的相對豐度顯著高于填閑大蔥，而Subgroup_6_norank的相對豐度顯著低于填閑大蔥（圖4）。

圖2 3種填閑作物對土壤中細菌主要綱群落結(jié)構(gòu)的影響

圖3 3種填閑作物對土壤中細菌某些目群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.3 不同作物填閑對真菌門和綱水平的影響 在土壤真菌群落中觀察到5個主要的門，Ascomycota在3種填閑處理中均是最豐富的門，占總有效序列的66.87%～76.10%；Zygomycota是填閑小麥、普通白菜處理中較豐富的門，分別占總有效序列的15.20%、16.19%；Basidiomycota是填閑大蔥處理中較豐富的門，占總有效序列的20.63%；此外，許多序列被歸類為Fungi_unclassified，其相對豐度為1.71%～2.09%（圖5）。在真菌綱水平上，填閑大蔥處理中Zygomycota_incertae_sedis的相對豐度較低，Tremellomycetes和Fungi_unclassified的相對豐度較高；填閑小麥處理中Ascomycota_unclassified的相對豐度較低，Sordariomycetes和Dothideomycetes的相對豐度較高；填閑普通白菜處理中Pezizomycetes和Eurotiomycetes的相對豐度較高（圖6）。

圖4 3種填閑作物對土壤中細菌某些屬群落結(jié)構(gòu)的影響

圖5 3種填閑作物對土壤中真菌主要門群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.4 不同作物填閑對真菌目和屬水平的影響 在真菌目水平上，填閑小麥處理中Hypocreales和Pleosporales的相對豐度顯著高于填閑大蔥和普通 白 菜， 而 Ascomycota_unclassified、Pezizales、Sordariales和Dothideomycetes_incertae_sedis的相對豐度顯著低于填閑大蔥和普通白菜；填閑大蔥處理 中Cystofilobasidiales和Ascomycota_unclassified的相對豐度顯著高于填閑小麥和普通白菜，而Mortierellales、Filobasidiales和 Pleosporales的相對豐度顯著低于填閑小麥和普通白菜；填閑普通白菜 處 理 中 Eurotiales、Onygenales、Microascales、Sordariales、Pezizales和 Mortierellales的相對豐度顯著高于填閑小麥和大蔥，而Sordariomycetes_unclassified的相對豐度顯著低于填閑小麥和大蔥（圖7）。在真菌屬水平上，填閑小麥處理中Fusarium、Pyrenochaeta、Nectriaceae_unclassified和Preussia的相對豐度顯著高于填閑大蔥和普通白 菜， 而 Ascomycota_unclassified、Hypocreales_unclassified和Humicola的相對豐度顯著低于填閑大蔥和普通白菜；填閑大蔥處理中Guehomyces、Pseudaleuria和Ascomycota_unclassified的相對豐度顯著高于填閑小麥和普通白菜，而Cryptococcus、Cephaliophora、Fusarium、Pyrenochaeta和Mortierella的相對豐度顯著低于填閑小麥和普通白菜；填閑普通白菜處理中Mortierella和Humicola的相對豐度顯著高于填閑大蔥和小麥，而Sordariomycetes_unclassified和Cephaliophora的相對豐度顯著低于填閑大蔥和小麥（圖8）。

圖6 3種填閑作物對土壤中真菌主要綱群落結(jié)構(gòu)的影響

圖7 3種填閑作物對土壤中真菌某些目群落結(jié)構(gòu)的影響

圖8 3種填閑作物對土壤中真菌某些屬群落結(jié)構(gòu)的影響

圖9 3種填閑作物的土壤細菌（a）和真菌（b）的主成分分析（PCA）結(jié)果

2.2.5 不同作物填閑處理的16S rRNA和ITS的主成分分析 主成分分析（PCA）結(jié)果表明不同作物填閑處理的土壤微生物群落存在差異（圖9）。在土壤細菌群落中主成分1（PC1）的貢獻率為61.65%，主成分2（PC2）的貢獻率為38.35%。從圖9-a可以看出，填閑小麥在PC1上與填閑大蔥和普通白菜明顯分開，填閑大蔥與填閑普通白菜在PC2上明顯分開，說明3種填閑作物的土壤細菌群落組成均存在明顯差異。在土壤真菌群落中PC1的貢獻率為81.77%，PC2的貢獻率為18.22%。從圖9-b可以看出，填閑大蔥與填閑普通白菜和小麥在PC1上明顯分開，填閑普通白菜和填閑小麥在PC2上明顯分開，說明3種填閑作物的土壤真菌群落組成亦存在明顯差異。

3 結(jié)論與討論

本試驗對黃瓜連作3 a的土壤進行3種填閑處理，分析不同填閑作物對土壤細菌群落和真菌群落的影響。結(jié)果表明，3種作物填閑處理土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)差異不大，但是微生物的相對豐度存在較大差異。此外，每種填閑作物都有其特異性微生物菌群，這與前人的研究結(jié)果一致（Nair & Ngouajio，2012；Detheridge et al.，2016），可能與作物殘茬分解釋放的次生代謝產(chǎn)物不同有關(guān)。

本試驗結(jié)果表明，細菌群落和真菌群落在相對豐度和多樣性方面對填閑作物有不同的響應(yīng)。細菌群落中菌群豐度和多樣性較高的是大蔥，而真菌群落中較高的是普通白菜。填閑小 麥 處 理 中 Flexibacter、Nitrosomonadaceae_uncultured、Anaerolineaceae_unculture、Ascomycota_unclassified、Hypocreales_unclassified和Humicola的相對豐度顯著低于填閑大蔥和普 通 白 菜， 而 Flavobacterium、Clostridium、Peptostreptococcaceae_incertae_sedis、Fusarium、Pyrenochaeta、Nectriaceae_unclassified和 Preussia的相對豐度顯著高于填閑大蔥和普通白菜。填閑小麥處理中Fusarium的相對豐度最高，與前人的研究結(jié)果不一致（Gao et al.，2017），這可能與土壤及填閑作物的腐解程度有關(guān)。填閑作物可以影響土壤微生物群落的豐富度和多樣性（Li et al.，2017）。通常，土壤微生物多樣性的增加對土壤健康和功能有利（Wagg et al.，2014）。這些結(jié)果表明不同填閑作物的土壤微生物的多樣性不同。

Gao等（2017）研究表明，填閑小麥可以通過改變土壤養(yǎng)分和調(diào)節(jié)土壤微生物群落來促進黃瓜幼苗的生長，可以增加細菌和真菌的多樣性，減少一些有害的真菌。大蔥提取物在填閑處理中，可以大大降低青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）的種群數(shù)量和番茄青枯病（tomato bacterial wilt）的發(fā)病率（Deberdt et al.，2012）。本試驗中，主成分分析結(jié)果表明所有樣品的土壤微生物群落都明顯地分離，說明土壤微生物群落主要受填閑作物的影響。3種填閑作物的細菌菌群和真菌菌群的豐度組成均存在明顯差異，說明不同填閑作物對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響存在差異。然而，本試驗中沒有設(shè)置空閑對照，填閑與連作相比是否更有利于改善土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)？夏季填閑小麥、冬季填閑大蔥或葉菜類蔬菜與連作相比的差異微生物種類有哪些？都有待于下一步研究證實。