姚鵬程 屠秀強(qiáng)

(1 上海市格致中學(xué) 上海 201401； 2 浙江省紹興市元培中學(xué) 紹興 312000)

放射性同位素標(biāo)記法也稱放射性同位素示蹤法，是指應(yīng)用放射性同位素原子追蹤物質(zhì)的運(yùn)行和變化規(guī)律，研究有機(jī)反應(yīng)歷程的方法。其依據(jù)的原理為放射性元素及它們的化合物與自然界存在的相應(yīng)普通元素及其化合物之間的化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)相同。因此，可用同位素作為一種標(biāo)記代替相應(yīng)的非標(biāo)記化合物。利用放射性同位素不斷地放出特征射線的核物理性質(zhì)，即可用核探測器隨時(shí)追蹤它在體內(nèi)或體外的位置、數(shù)量及其轉(zhuǎn)變等。高中生物學(xué)教材中光合作用中氧氣的來源、卡爾文循環(huán)中碳的同化、T2噬菌體侵染細(xì)菌證明DNA是遺傳物質(zhì)、DNA的半保留復(fù)制以及分泌蛋白的合成及分泌途徑的證實(shí)均運(yùn)用到同位素標(biāo)記法。而同位素標(biāo)記法在生命科學(xué)理論研究中的應(yīng)用遠(yuǎn)不止于此，本文將光合作用、遺傳信息表達(dá)相關(guān)的、利用放射性同位素標(biāo)記法進(jìn)行的理論研究進(jìn)行了梳理。

1 光合作用研究中同位素標(biāo)記法的應(yīng)用

18世紀(jì)后期，伴隨著拉瓦錫新化學(xué)體系的建立，人類開始了對光合作用的認(rèn)識。繼1771年英國化學(xué)家普利斯特利(J. J. Priestley)通過把薄荷枝條和老鼠一同放入玻璃罩內(nèi)生長的簡單實(shí)驗(yàn)，首先發(fā)現(xiàn)植物可“凈化”空氣的現(xiàn)象，在短短35年內(nèi)，“凈化”空氣所必需的幾個(gè)重要因素——植物綠色物質(zhì)、光、二氧化碳和水便分別為荷蘭人英格豪斯(J. Ingenhousz)、瑞士牧師塞尼比爾(J. Senebier)及瑞士化學(xué)家索熱爾(D.Saussure)所發(fā)現(xiàn)。19世紀(jì)30年代末，一系列關(guān)于動物細(xì)胞可固定二氧化碳的發(fā)現(xiàn)等種種事實(shí)表明：二氧化碳同化并非僅發(fā)生在自養(yǎng)生物中的一種特殊的光解反應(yīng)，而很可能為一種酶促的暗反應(yīng)。

隨著放射性同位素示蹤技術(shù)的應(yīng)用，二氧化碳同化的過程也逐漸明朗，1937年，美國加州大學(xué)伯克利分校的魯賓(S. Ruben)和卡門(M. D. Kamen)首先用放射性11C為示蹤原子證明光合作用中二氧化碳固定是暗的酶促反應(yīng)，只是由于11C半衰期太短且無合適方法分析二氧化碳受體而難以鑒定。而在前人已經(jīng)探明光合作用反應(yīng)物和生成物的前提下，魯賓和卡門根據(jù)質(zhì)量守恒定律，生成物中的原子來自反應(yīng)物，光合作用產(chǎn)生的氧氣必然來自反應(yīng)物(水或二氧化碳)設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)。將18O分別標(biāo)記H2O和CO2，使它們分別成為H218O和C18O2。進(jìn)行兩組實(shí)驗(yàn)：第一組向小球藻提供H218O和CO2，結(jié)果釋放的氧氣全部是18O2；第二組向植物提供H2O和C18O2，結(jié)果釋放的氧氣全部是O2。得出光合作用中產(chǎn)生的氧氣來自于水。但這并沒有解決二氧化碳同化的機(jī)制問題。

圖1 卡爾文14C標(biāo)記的雙相紙層析放射自顯影圖譜

二次大戰(zhàn)以后,長壽命的示蹤原子已可投入實(shí)驗(yàn)室使用，為生物學(xué)工作者帶來了福音。在伯克利分校的著名物理學(xué)家勞倫斯(E. O. Larence)建議下，一向?qū)夂献饔酶信d趣的化學(xué)家卡爾文(M. Calvin)組建了一個(gè)新的生物—有機(jī)化學(xué)研究小組繼續(xù)魯賓等人的工作，用14C研究碳同化機(jī)制?？栁膶⑴囵B(yǎng)出來的多組小球藻置于含未標(biāo)記CO2的密閉容器中，將14C標(biāo)記的14CO2注入容器，分別培養(yǎng)3s、 5s、 6s、 7s、 30s，將小球藻浸入熱乙醇中殺死，使細(xì)胞中的酶變性失活，提取溶液里的含碳化合物分子。采取有機(jī)分析方法提取并鑒定全部含14C的標(biāo)記物，卡爾文獲得了有關(guān)碳循環(huán)的部分信息。在引入雙相紙層折和放射性自顯影等新方法后，使分析速度和精度大為提高，很快便分離、鑒定了一批在同化早期出現(xiàn)的糖磷酸(圖1)。經(jīng)不斷分析、比較、修改與完善，卡爾文小組最終排列出了從第一個(gè)穩(wěn)定產(chǎn)物——磷酸甘油酸到所有早期產(chǎn)物的相對位置，從而建立了最重要的生物合成反應(yīng)——光合作用碳同化途徑。不久，有關(guān)酶類也全被一一分離、純化和證實(shí)，為后來對光合作用調(diào)節(jié)控制的探討開辟了道路。

同時(shí)，1904年，植物學(xué)家哈伯蘭特(G．Haberlandt)用光學(xué)顯微鏡觀察一些草本植物時(shí)發(fā)現(xiàn)禾本科黍亞科的葉具有特殊的花環(huán)結(jié)構(gòu)。在1927年，尚茨(H. L. Shantz)和L. N. Piemeisel發(fā)現(xiàn)，具有花環(huán)結(jié)構(gòu)的植物合成單位干物質(zhì)的耗水量只有其他植物的1/2左右。1944年，羅迪斯(M. M. Rhoades)和卡瓦略(A. Carvalho)在顯微鏡下觀察到這類植物的淀粉僅集中在維管束鞘細(xì)胞里，而不像其他植物那樣散布在葉肉細(xì)胞中。1962年，研究人員發(fā)現(xiàn)，具有花環(huán)結(jié)構(gòu)的植物具有較低的CO2補(bǔ)償點(diǎn)。1963年，發(fā)現(xiàn)具有花環(huán)結(jié)構(gòu)的植物具有潛在的高生長效率。

期間在1952年，美國夏威夷食糖種植協(xié)會的科學(xué)家科思謝克(H.P.Kortschak)出于好奇，想了解C3途徑是否也適合于甘蔗一類的植物。用14C標(biāo)記二氧化碳，同樣用雙相紙層析和放射自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)首先出現(xiàn)的放射性化合物并不是3-磷酸甘油酸。1956—1957年間，科思謝克發(fā)表文章表明，甘蔗葉中最早被標(biāo)記的3種化合物中，首先是蘋果酸和天冬氨酸，其次才是磷酸甘油酸[1]。同時(shí)，有學(xué)者在高粱中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，這些植物都屬于生活在熱帶的禾本科黍亞科植物。無獨(dú)有偶，1960年，蘇聯(lián)科學(xué)家卡貝洛夫研究玉米葉片光合作用時(shí)，也發(fā)現(xiàn)CO2同化的最初產(chǎn)物為蘋果酸和天冬氨酸，為之后C4途徑的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

2 DNA及遺傳信息表達(dá)研究中同位素標(biāo)記法的應(yīng)用

在格里菲斯(F. Griffith)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)提出轉(zhuǎn)化因子后，埃弗里(O. T. Avery)從III型s型肺炎雙球菌中分離得到了活性的轉(zhuǎn)化因子，但當(dāng)時(shí)由于許多科學(xué)家始終抱著在核酸中的少量污染物也許就是遺傳物質(zhì)這樣一種希望，因此大量的工作都用于提純這些轉(zhuǎn)化因子。直到1952年，人們對DNA的作用問題仍然保持著謹(jǐn)慎態(tài)度。甚至當(dāng)高純度的DNA制備物只含有少于0.02%的蛋白質(zhì)都被證明為對轉(zhuǎn)化作用有效。直到赫爾希(A. Hershey)和蔡斯(M. Chase)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，為DNA是遺傳物質(zhì)提供了令人信服的證據(jù)。赫爾希開始進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)時(shí)，對核酸進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的可能性是相當(dāng)懷疑的。安德森(T. F. Anderson)記得，在冷泉港實(shí)驗(yàn)室的某一天，他和赫爾希討論了一種“極其滑稽”的可能性，即只有病毒的DNA進(jìn)入寄主細(xì)胞，并像轉(zhuǎn)化因子一樣改變了細(xì)胞的合成過程。

赫爾希和蔡斯用分別被35S或32P標(biāo)記的T2噬菌體侵染未被放射性同位素標(biāo)記的宿主菌，分離宿主菌和噬菌體，離心后測定宿主菌細(xì)胞的放射性。被35S標(biāo)記的噬菌體，其放射性出現(xiàn)在宿主菌細(xì)胞的外面，被32P標(biāo)記的噬菌體其放射性，主要集中在宿主菌細(xì)胞內(nèi)。

與別的科學(xué)家不同的是，早在1951年沃森(J. Waston)就對DNA是遺傳物質(zhì)深信不疑，即想證明DNA是遺傳物質(zhì)。隨后，沃森遇到了克里克(F. Crick)并利用富蘭克林(R. Franklin) X衍射的資料，結(jié)合自己的猜想提出DNA反向平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。在沃森—克里克結(jié)構(gòu)模型中，科學(xué)家可以推測到DNA“怎樣在每一個(gè)細(xì)胞世代中自我復(fù)制”。而當(dāng)時(shí)具有三種猜想：全保留復(fù)制，半保留復(fù)制以及彌散復(fù)制。直到1958年梅塞爾森(M. S. Meselson)和斯塔爾(F. Stahl)設(shè)計(jì)了DNA復(fù)制的放射性同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，才明確DNA的復(fù)制方式為半保留復(fù)制。

他們利用15N標(biāo)記的大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)材料，提取其中DNA，進(jìn)行密度梯度離心，得到的條帶表明：被標(biāo)記的DNA15N/15N密度較大，位于離心管的下部，即重帶。取被15N標(biāo)記的大腸桿菌放入14NH4Cl為唯一氮源的培養(yǎng)液中，大腸桿菌分裂一次(20min)，DNA復(fù)制一次后取出，提取DNA進(jìn)行密度梯度離心，得到的條帶表明：只有一種密度的DNA(15N/14N)，且其密度較兩條鏈均被15N標(biāo)記的DNA小，位于離心管的中部，即中帶。待大腸桿菌再分裂一代，即DNA再復(fù)制一次，進(jìn)行相同的操作，得到的條帶表明：此時(shí)有兩種密度的DNA出現(xiàn)，其中一條帶的DNA密度和復(fù)制一次的密度相同(15N/14N)，另一新條帶，密度最小(14N/14N)，位于離心管的上部，即輕帶。實(shí)驗(yàn)按照上述程序持續(xù)進(jìn)行，在以后各代DNA中，密度梯度離心的結(jié)果均顯示：有兩種密度的DNA分子出現(xiàn)，且其密度和復(fù)制兩次時(shí)的情形相同。

而在1955年，布拉切特(J. Brachet)用洋蔥根尖和變形蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)如加入RNA酶，分解掉細(xì)胞內(nèi)的RNA，蛋白質(zhì)的合成就停止；如果再加入從酵母中提取出來的RNA，則會又重新合成一定數(shù)量的蛋白質(zhì)。這表明蛋白質(zhì)的合成與RNA直接相關(guān)。同年，戈?duì)柎奶?J. L. Golstein)和普勞特(Plaut)等用放射性同位素標(biāo)記變形蟲細(xì)胞核內(nèi)的RNA，觀察到標(biāo)記的RNA從細(xì)胞核相繼進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。因此，猜測RNA很可能是DNA和蛋白質(zhì)合成之間的信使。

同年，利特菲爾德(Littlefield)對小鼠飼喂用14C標(biāo)記的亮氨酸。不久將小鼠殺死，取出肝細(xì)胞并分離其組成成分。發(fā)現(xiàn)大部分14C標(biāo)記的亮氨酸已摻入蛋白質(zhì)，并且與核糖體有聯(lián)系。為此，他首先提出了核糖體是合成蛋白質(zhì)的場所。至此，放射性同位素標(biāo)記法已將中心法則的核心內(nèi)容一一證實(shí)。

隨即又有科學(xué)家以T2噬菌體DNA為模板制成用32P標(biāo)記的RNA，取一定量T2-DNA和其他種類的DNA加入此32P的RNA中，經(jīng)加熱使DNA雙鏈打開，并溫育，用密度梯度離心或微孔膜分離出DNA-32P RNA復(fù)合體測其放射性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果只有菌體T2的DNA能與該32P標(biāo)記的RNA形成放射性復(fù)合體。從而證實(shí)了RNA與DNA模板的堿基呈特殊互補(bǔ)配對關(guān)系[2]。

科學(xué)家又對鳥嘌呤核糖核苷酸(GMP)的堿基和核糖上分別都標(biāo)記上14C，在離體系統(tǒng)中使之參入脫氧鳥嘌呤核苷酸(dGMP)，然后將原標(biāo)記物和產(chǎn)物分別進(jìn)行酸水解和層析分離后，測定它們各自的堿基和戊糖的放射性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們兩部分的放射性比值基本相等。證明了脫氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接轉(zhuǎn)化而來的，并不是從頭合成[3]。

此外，如動物原腸胚三胚層的發(fā)育、動物體內(nèi)甲狀腺的作用、確定膽固醇的體內(nèi)合成途徑實(shí)驗(yàn)、確定植物體內(nèi)礦質(zhì)元素運(yùn)輸?shù)耐緩綄?shí)驗(yàn)、植物體內(nèi)吲哚乙酸的運(yùn)輸?shù)壬茖W(xué)實(shí)驗(yàn)，均利用了放射性同位素標(biāo)記法。

3 小結(jié)

放射性同位素標(biāo)記法的使用貫穿整個(gè)生命科學(xué)史，教師可將與同位素標(biāo)記法有關(guān)的生物科學(xué)史有意識地引入到光合作用、遺傳信息表達(dá)的教學(xué)中，將間接知識經(jīng)驗(yàn)轉(zhuǎn)化為具體的探究歷程，從而調(diào)動學(xué)生思維的積極性，從多方面培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)生物學(xué)的興趣，促使學(xué)生勇于探索生命的規(guī)律，培養(yǎng)科學(xué)精神和創(chuàng)新意識。