高 贏 虞桂琴

(湖北省襄陽市第五中學 襄陽 441057)

“基因工程的基本操作程序”是人教版高中生物學選修3中的重要內(nèi)容，本文就其中有關基因文庫教學的一些疑難問題進行分析。

1 為何構(gòu)建基因文庫

為什么科研人員要費時、費力地去構(gòu)建基因文庫？構(gòu)建基因文庫的目的是什么？如果所需要的目的基因序列已知，可以通過PCR方法從含有目的基因的生物的DNA中分離得到；如果目的基因的mRNA可以獲得，可以通過反轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因；但如果目的基因序列未知或者想從一種生物體內(nèi)獲得多種基因以及想得到某一種生物的全部基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。

2 如何構(gòu)建基因文庫

利用超聲波將細胞破碎后，提取到細胞內(nèi)的總DNA。由于其中目的基因片段含量很少，且掩埋在無數(shù)其他基因片段中，難以檢出和分離。因此，要用限制性內(nèi)切酶將總DNA切成許多小的片段[1]。通常采用識別序列較短的限制酶部分消化所得片段的隨機程度比識別序列長的限制酶消化片段要高些，這樣將有利于后續(xù)對基因的提取。例如，用識別4個核苷酸序列的限制酶MboⅠ和Sau3A，就可以盡可能地覆蓋整個基因組[2]。然后，將每一個DNA分子片段和質(zhì)?；蚴删w載體相連接(λ噬菌體是常用的載體，因為該載體有BamHⅠ的切點，而BamHⅠ與Sau3A是一對同尾酶，切割出來的末端可以互補配對[3])。進一步用重組的λ噬菌體載體去感染大腸桿菌受體細胞或者將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，從而得到一個含某一生物全部基因的受體菌群。如果將某生物體的基因看成是一本本書，那么受體菌群就像是一個圖書館。因此，人們形象地把這個受體菌群稱為該生物的基因組文庫。

在教學過程中，教師應盡可能編制軟件或利用掛圖把抽象的過程形象化，還可以設置一些問題來加深學生的印象：如構(gòu)建基因組文庫的成員有哪些？每個受體菌之間的最主要的差別是什么？

3 基因組文庫與cDNA文庫的區(qū)別

根據(jù)包含某生物基因的多少可將基因文庫分為基因組文庫和部分基因文庫?；蚪M文庫包含了某一生物的全部基因，部分基因文庫就是包含了該生物的部分基因。例如，以某生物X染色體上全部基因構(gòu)建的基因文庫、以某生物線粒體內(nèi)的全部基因構(gòu)建的線粒體基因文庫、cDNA文庫等都屬于部分基因文庫。其中，cDNA文庫是部分基因文庫的典型代表。

如何構(gòu)建cDNA文庫呢？通過提取某一發(fā)育階段的生物體細胞中的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，把獲得的cDNA與載體相連后導入到受體菌群中，這樣就構(gòu)建了該生物的cDNA文庫。cDNA文庫是沒有啟動子和內(nèi)含子的，而基因組文庫是通過提取生物體細胞中的DNA得到的，是有啟動子和內(nèi)含子的。因此，基因組文庫大，cDNA文庫小。

在教學中，可先引導學生回顧細胞中的mRNA是怎么得到的，并設置一些問題：基因表達過程中，啟動子和終止子在轉(zhuǎn)錄過程中起什么作用？它們會不會轉(zhuǎn)錄成mRNA的一部分？真核生物細胞轉(zhuǎn)錄得到的mRNA是如何加工的？通過問題討論，學生明白了為什么基因組文庫會包含啟動子和內(nèi)含子，而cDNA文庫不包含啟動子和內(nèi)含子。

4 如何從基因文庫中獲取目的基因

4.1 核酸雜交法 核酸雜交法是從基因文庫中獲取目的基因比較有效而快速的一種方法。用帶放射性標記的特異DNA作為探針，通過分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號，能從浩瀚的基因組中把目的基因顯示出來。顯然，篩選的關鍵是獲得特異性探針。如果目的基因的序列是已知的或部分序列已知，那么獲取探針就很容易，但大部分情況下，目的基因的序列是未知的，這時探針的來源有：①以某種生物實驗體系中已分離到的基因序列，作為從與之有親緣關系的生物中分離相關基因的核酸探針，因為親緣關系相近的生物之間，基因編碼序列的同源性高于非編碼區(qū)的序列。②由于蛋白質(zhì)家族的保守性，功能相同或相近的蛋白質(zhì)具有共同氨基酸序列的區(qū)段。因此，可根據(jù)蛋白質(zhì)序列來合成基因探針。但由于密碼子具有簡并性，通過蛋白質(zhì)氨基酸序列合成的寡核苷酸探針，通常是混合物的形式，在這種探針庫中，只有一種是與目的基因完全互補的。

4.2 PCR篩選法 PCR技術除了可以擴增目的基因外，還可以分離目的基因。PCR篩選法操作簡單，但前提是要知道目的基因的一段序列，并獲得基因特異性引物。要從一個基因組文庫中獲取目的基因，可先將整個基因文庫(以受體菌形式)保存在多孔培養(yǎng)板上，用設計好的目的基因引物進行PCR篩選，鑒定出陽性孔。圖1展示如何用PCR技術從一個DNA分子片段中獲取目的基因(該DNA分子片段上有3個基因，基因2是目的基因，通過PCR三次循環(huán)，就可以將基因2分離出來)。

圖1 通過PCR技術分離目的基因

4.3 根據(jù)表達產(chǎn)物篩選目的基因 基因文庫是用基因表達載體構(gòu)建的，每個克隆都可以在受體菌中表達，產(chǎn)生一段多肽。如果目的基因序列完全未知，但對該基因表達產(chǎn)物有一定的了解，那么可以用以下幾種方式篩選出目的基因：①免疫篩選法。用特異性抗體可以十分靈敏地檢測到目的基因的表達產(chǎn)物。②檢測表達產(chǎn)物功能活性。例如，若產(chǎn)物是酶，可通過酶促反應來檢測。③檢測產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。如產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量、肽譜等。