李媛媛，李星，張立偉，蔡永陽(yáng)，黃治國(guó)，2，*，任志強(qiáng)，2，*

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川自貢643000）

生料釀酒技術(shù)最早由日本人在20世紀(jì)50年代提出，20世紀(jì)70年代世界各國(guó)競(jìng)相研究，我國(guó)的生料釀酒技術(shù)曾在20世紀(jì)80年代掀起過高潮[1]。生料釀酒與傳統(tǒng)釀酒相比，免去了浸泡、初蒸、燜糧等八道工序，節(jié)約燃料35%～60%，出酒率高，減少人工50%以上，降低生產(chǎn)成本30%以上，具有較高的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，是現(xiàn)代釀酒行業(yè)的發(fā)展方向之一[2－4]。

不同的糧食釀出來的酒具有不同的特點(diǎn)；相同的糧食加入不同的微生物進(jìn)行發(fā)酵，酒質(zhì)也會(huì)有較大的差別，其原因可能為不同微生物的代謝通路存在一定的差別[5－6]。不同的釀酒原料的最適釀造微生物可能不同[7]。因此，篩選針對(duì)某一特定原料進(jìn)行釀酒的微生物具有研究意義。

目前有很多關(guān)于相同曲藥、不同原料的生料釀酒釀造特性研究[8－10]；而很少有關(guān)于同一種原料，不同發(fā)酵微生物釀酒釀造特性研究。為了獲得針對(duì)以大米為原料，發(fā)酵性能優(yōu)良、性狀穩(wěn)定的生料釀造菌株，本研究通過構(gòu)建大米生料釀酒實(shí)驗(yàn)室研究平臺(tái)，對(duì)18株酵母進(jìn)行了以大米為原料的生料釀酒發(fā)酵研究，篩選出一株較適合用于大米生料釀酒的微生物。該酵母可作為大米釀酒生料曲的備選菌株；該方法對(duì)生料釀酒的菌種篩選具有指導(dǎo)意義。針對(duì)不同的原料采用不同的微生物制備的生料曲進(jìn)行釀造，以提高生料釀酒的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌：由四川理工學(xué)院釀酒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心提供；大米：市售秈米；糖化酶：江蘇博立生物制品有限公司；淀粉酶：上海康達(dá)食品工程有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

250HL恒溫恒濕培養(yǎng)箱：金壇市醫(yī)療儀器廠；VG－3渦旋振蕩器：德國(guó)進(jìn)口；SHP生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母的活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

取釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的酵母菌斜面，取酵母菌接種于含10 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的試管中，28℃，120 r/min，24 h振蕩培養(yǎng)對(duì)酵母菌進(jìn)行復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的培養(yǎng)液采用劃線分離的方式劃線于PDA固體培養(yǎng)中，28℃恒溫培養(yǎng)24 h。

從活化后的培養(yǎng)基中挑取生長(zhǎng)良好的酵母菌，接種于10 mL PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min培養(yǎng)12 h。1%的轉(zhuǎn)種量接種于150 mL PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min培養(yǎng)12 h獲得種子液。6 000 r/min離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌3次后獲得鮮酵母。

1.3.2 酒的發(fā)酵與蒸餾

大米100 g，自來水250 mL、糖化酶1 g、淀粉酶1 g，鮮酵母1 g（濕重），置于500 mL三角瓶中，攪拌均勻，保鮮膜封口，25℃發(fā)酵20 d。

將發(fā)酵好的發(fā)酵醪液全部轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，加入沸石，連接好蒸餾裝置進(jìn)行蒸餾取酒；每個(gè)樣品蒸餾200 mL酒樣。

1.3.3 失重的測(cè)定

失重即經(jīng)酵母發(fā)酵前后發(fā)酵液質(zhì)量的變化。失重/g=原重－剩重

1.3.4 出酒率的測(cè)定

將1.3.2中蒸餾得到的酒樣用酒精計(jì)測(cè)得每組酒樣的酒精度，每組酒樣測(cè)3次，取平均值。

出酒率/%=酒精度×蒸餾后酒樣的量×乙醇的密度÷大米投加量

1.3.5 總酯的測(cè)定

吸取50 mL酒樣于圓底燒瓶中，加2滴酚酞指示劑，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至粉紅色，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積。再準(zhǔn)確加入氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液20 mL，加入3粒沸石并裝好冷凝回流裝置，于沸水浴上回流30 min，取下，冷卻。然后，用硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行滴定，以微紅色剛好完全消失為其終點(diǎn)，記錄消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積。同時(shí)吸取50 mL酒樣，做空白試驗(yàn)作對(duì)照，記錄消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積。

計(jì)算公式：

式中：X為酒樣中總酯的含量，g/L；c為硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的實(shí)際濃度，mol/L；V0為空白試驗(yàn)樣品消耗0.1 mol/L H2SO4溶液的體積，mL；V1為樣品消耗0.1 mol/L H2SO4溶液的體積，mL。

1.3.6 總酸的測(cè)定

吸取50 mL酒樣于錐形瓶中，加酚酞2滴，以氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定樣品至微紅色，即為其終點(diǎn)，并記錄數(shù)據(jù)。計(jì)算公式：

式中：X為酒樣中總酸的含量，g/L；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的實(shí)際濃度，mol/L；V為消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL。

1.3.7 氣相色譜質(zhì)譜條件

1.3.7.1 氣相色譜（gas chromatography，GC）條件

毛細(xì)管柱；程序升溫：初始溫度40℃保持1 min，然后以5℃/min升溫至180℃，保持1 min，再8℃/min升溫到230℃，保持7 min；進(jìn)樣口溫度240℃；載氣：高純度氦氣（He），流速為1 mL/min；不分流進(jìn)樣。

1.3.7.2 質(zhì)譜（mass spectrometer，MS）條件

電子電離源（electronionization，EI），電子能力70eV，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，接口溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍20 u～50 u，溶劑延遲3 min。

1.3.8 定性與成分分析

定性分析：檢測(cè)出揮發(fā)性組分的質(zhì)譜圖，通過與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)（NIST05a.L）對(duì)比鑒定，匹配度大于75%的予以確認(rèn)。

成分分析：通過GC－MS分析檢測(cè)得出白酒的風(fēng)味物質(zhì)的總離子流圖，采用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行譜庫(kù)（NIST8.0）檢索及相關(guān)文獻(xiàn)分析，對(duì)相應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

市售生料釀酒曲至少包含有兩種微生物，根霉和酵母。其中，根霉主要提供糖化所需的酶類，將釀酒原料轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵性糖，酵母的主要作用是將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)變成乙醇[11]。試驗(yàn)要探索不同酵母對(duì)大米生料釀酒的釀造特性，就要固定其他條件，只改變酵母的種類。為了最大限度的減少其他微生物對(duì)酵母的影響，本研究采用“糖化酶+酵母”的模式構(gòu)建生料釀酒實(shí)驗(yàn)室研究平臺(tái)。以相同的原料投加量，相同酶的投加量，相同的發(fā)酵溫度進(jìn)行試驗(yàn)，從失重、出酒率、總酯、總酸和風(fēng)味物質(zhì)等方面考查不同酵母對(duì)大米生料釀酒的釀造特性。

2.1 不同酵母生料發(fā)酵前后的失重

酵母將淀粉轉(zhuǎn)化為CO2、酒精和其他副產(chǎn)物等；在發(fā)酵期間失去的重量就是CO2的質(zhì)量，CO2的產(chǎn)量越多，說明其發(fā)酵起步早、速度快，能較早的達(dá)到主發(fā)酵期，形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，較好的抑制雜菌，使發(fā)酵過程中的生理生化反應(yīng)正常進(jìn)行，對(duì)酒的質(zhì)量有初步的保證，酵母的發(fā)酵性能較為良好；本研究的18種酵母發(fā)酵前后失重?cái)?shù)據(jù)見圖1。

圖1 不同酵母發(fā)酵前后的失重Fig.1 Weightlessness before and after fermentation of different yeast

如圖1，失重最高的是酵母1，達(dá)到了41.85 g；其中酵母18、酵母6、酵母10、酵母11、酵母15這5株酵母菌種的失重都超過了41 g，失重最低的是酵母12，只有25.52 g，在相同條件下，只是加入的酵母不同其失重也存在一定的差異，說明酵母的不同的確會(huì)影響發(fā)酵后發(fā)酵液里的物質(zhì)成分。

2.2 不同酵母生料發(fā)酵的出酒率

酵母在分解大米中的淀粉時(shí)，酒精和CO2是同一反應(yīng)的產(chǎn)物，即CO2產(chǎn)生的量越多，酒精產(chǎn)生越多；也就是說失重多，出酒率就高；失重直觀的反映了菌種在釀酒過程中對(duì)原料的使用情況，出酒率反映菌株對(duì)原料的轉(zhuǎn)化率；通過對(duì)這兩者的測(cè)定就能更好的反映不同酵母的發(fā)酵性能；酵母出酒率數(shù)據(jù)見圖2。

淀粉轉(zhuǎn)化為酒精的理論值為56.76%，而大米的淀粉含量為75%，如果按淀粉轉(zhuǎn)化為酒精是100%，大米的理論出酒率也只能達(dá)到42.57%[12]；但由于使用糖化酶，減少了霉菌對(duì)大米中淀粉的消耗，添加鮮酵母，酵母繁殖的淀粉消耗要少一些，如圖2可以看出這樣做其出酒率可以高達(dá)43.13%，但也有較低的出酒率為24.49%，其他都介于兩者之間，說明不同酵母大米生料發(fā)酵對(duì)出酒率的影響是不相同的。

圖2 不同酵母發(fā)酵后的出酒率Fig.2 The yield of wine after fermentation by different yeast

2.3 不同酵母生料釀酒對(duì)白酒總酯的影響

總酯是白酒中多種酯的總稱，它是白酒中重要的呈香呈味物質(zhì)，總酯分析是白酒中重要的檢測(cè)項(xiàng)目，是判定白酒合格與否的重要指標(biāo)之一[13]。乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯是白酒中的三大主要酯類，其含量占總酯的90%上，總酯越高，白酒越香，所以說要比較酵母的發(fā)酵性能，比較其產(chǎn)出酒的總酯含量是必須的。

對(duì)發(fā)酵蒸餾后的酒樣進(jìn)行總酯的測(cè)定（具體方法見1.3.4）結(jié)果見圖3。

圖3 不同酵母對(duì)總酯的影響Fig.3 The effect of different yeast on the total ester

總酯含量最高的是酵母2，達(dá)到了0.69 g/L，最低的是酵母9，為0.45 g/L。其他的介于兩者之間?？傮w而言：酵母2、酵母15、酵母3的產(chǎn)酯能力較強(qiáng)，由圖3可知不同酵母以大米為原料進(jìn)行生料釀酒時(shí)產(chǎn)酯能力是存在差別的，其可能的原因有酵母本身產(chǎn)酯的能力存在差別，也有可能是對(duì)原料的利用上存在差別，比如同一種菌對(duì)不同的原料進(jìn)行發(fā)酵，其產(chǎn)酯能力也會(huì)存在差別[14]。

2.4 不同酵母生料釀酒對(duì)總酸的影響

白酒中的酸是主要呈味物質(zhì)之一，對(duì)白酒而言，它的酸類物質(zhì)主要由有機(jī)酸組成；酸與白酒中的酯、醇、醛等物質(zhì)相比，其作用力最強(qiáng)，功能相當(dāng)豐富，影響面廣，比如可以消除酒的苦味、是新酒老熟的有效催化劑、是白酒最重要的味感劑，同時(shí)還對(duì)白酒香氣有抑制和掩蓋作用，因此測(cè)定酒中的總酸含量也是必須的[15]。

對(duì)發(fā)酵蒸餾后的酒樣進(jìn)行總酸的測(cè)定，結(jié)果如圖4。

總酸含量最高的是酵母13，達(dá)到了1 g/L，最低的是釀酒酵母5，為0.06 g/L。其他的介于兩者之間?？傮w而言：酵母13、酵母3、酵母12的產(chǎn)酸能力強(qiáng)，說明不同酵母大米生料發(fā)酵對(duì)產(chǎn)酸的影響是不相同的。

2.5 不同酵母生料發(fā)酵對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

風(fēng)味物質(zhì)在白酒中只占3%左右，屬于白酒中的微量物質(zhì)，而這些微量成分可通過嗅覺、視覺、觸覺和味覺引起感官的刺激，其種類、含量和量比關(guān)系決定著白酒香型和風(fēng)味質(zhì)量，所以對(duì)酵母發(fā)酵后酒中的風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定有一定的必要性。生料釀酒中主要的風(fēng)味物質(zhì)有奇數(shù)碳脂肪酸乙酯、正丙醇、高級(jí)脂肪酸乙酯和乳酸乙酯，而在本研究中不同酵母生成的酒主要測(cè)出有丙醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯3個(gè)成分，且不同酵母生成3種物質(zhì)的量也各有不同，說明不同酵母對(duì)風(fēng)味物質(zhì)有一定的影響。

不同酵母生料發(fā)酵中白酒風(fēng)味物質(zhì)成分GC-MS分析。18種不同酵母發(fā)酵后酒樣的風(fēng)味物質(zhì)對(duì)比結(jié)果見圖5。

圖5 不同酵母發(fā)酵后對(duì)風(fēng)味物質(zhì)含量影響Fig.5 Effect of different yeast fermentation on flavor compounds content

從圖5中可以看出，不同酵母產(chǎn)酒的風(fēng)味成分可能會(huì)有所不同，風(fēng)味成分含量也有很大的區(qū)別，綜合來看酵母15、酵母3以及酵母10的3種風(fēng)味物質(zhì)含量很高，所以從風(fēng)味物質(zhì)的成分與含量來看這3種酵母的發(fā)酵性能較為良好。

3 結(jié)論

本研究通過不同酵母對(duì)大米的生料釀酒后，發(fā)酵液的失重、出酒率、總酯、總酸和風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定和對(duì)比篩選出以大米為原料生料釀酒的發(fā)酵性能較好的生產(chǎn)菌。結(jié)果表明：酵母1、酵母18、酵母6、酵母10、酵母11、酵母15這6株酵母菌種的失重都超過了41 g，失重越多說明該酵母能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳的能力越強(qiáng)，因此發(fā)酵后的還原糖和總糖的殘余量就越低；酵母1、酵母6、菌株酵母10、酵母15、酵母18出酒率較高，出酒率都超過了40%；通過GC-MS測(cè)定氣相成分得知：酵母15產(chǎn)酯能力較強(qiáng)，產(chǎn)酯含量超過了0.50 g/L。從以上數(shù)據(jù)可以看出酵母15無論從失重、出酒率和酒中風(fēng)味物質(zhì)都要比其他菌株好，所以酵母15在以大米為原料的生料釀酒中具有一定的優(yōu)勢(shì)，適合作為生產(chǎn)菌。