朱蘊(yùn)蘭，陳宏偉，陳安徽，王陶，邵穎，張城，石橋鋒，殷云杰，俞杰

（徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221111）

蛹蟲草（Cordyceps militaris（L.）Link）是指蛹擬青霉（Paecilomyces militaris）寄生于鱗翅目昆蟲蛹及幼蟲后形成的蟲菌復(fù)合體，在分類學(xué)上隸屬于真菌界（Fungi）、子囊菌門（Ascomycota）、肉座菌目（Hypocreales）、麥角菌科（Ciaviepiaceae）、蟲草屬（Cordyceps）[1－2]。已有研究表明，蛹蟲草與著名的藥用冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）為同屬，其活性成分十分相似，含有蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)人體免疫力、延緩衰老、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞等功效[3－5]。

大豆（Giycine max（L.）Merrill）營養(yǎng)成分豐富，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)35%～40%，是豬肉的2倍、雞蛋的2.5倍，此外還含有大量的脂肪，尤其是不飽和脂肪酸含量高，同時(shí)含有糖、鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素、異黃酮、膳食纖維等成分，具有抑制肥胖、延緩骨質(zhì)疏松、降低膽固醇、緩解高血壓、動脈硬化、心臟病、糖尿病等功能[6－9]。據(jù)預(yù)測，到2020年，植物基蛋白將擁有700億食品市場，而大豆基發(fā)酵產(chǎn)品將成為未來研發(fā)新熱點(diǎn)[10]。目前市場上的大豆產(chǎn)品很多，但發(fā)酵產(chǎn)品多以自然發(fā)酵為主，品種單一，保健功能不強(qiáng)，開發(fā)具有高效保健功能的高科技含量的大豆產(chǎn)品勢在必行。

目前，有關(guān)蛹蟲草的產(chǎn)品已有很多[11－15]，而關(guān)于蛹蟲草大豆的研究尚很少，只見少數(shù)幾篇文獻(xiàn)。彭志妮等[16]研究了蛹蟲草固體發(fā)酵大豆基質(zhì)不同發(fā)酵時(shí)間的pH值、淀粉酶、蛋白酶、糖、酚及抗氧化能力。樸美子等[17]研究了蛹蟲草黃豆對小鼠的抗氧化及免疫作用。利用蛹蟲草對其他物質(zhì)進(jìn)行固體發(fā)酵的研究也甚少，僅見賀曉玉[18]對蛹蟲草固體發(fā)酵五味子藥渣的工藝進(jìn)行了優(yōu)化并對發(fā)酵產(chǎn)物對仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的影響進(jìn)行了研究。閏梅霞等[19]對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵人參產(chǎn)物的有效成分含量進(jìn)行了測定。陳雪巧等[20]對蛹蟲草發(fā)酵苦蕎菌質(zhì)的成分及抗氧化活性進(jìn)行了研究。

“雙向固態(tài)發(fā)酵”是藥用菌以含有藥效成分的底物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵底物在提供真菌生長所需營養(yǎng)的同時(shí)又能被真菌的代謝所改變，使底物的成分發(fā)生變化，同時(shí)由于菌體生長產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，賦予發(fā)酵菌質(zhì)之中，使發(fā)酵菌質(zhì)含有豐富的功效成分[21]。

本文利用蛹蟲草具有較強(qiáng)的生物降解能力和物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，對大豆進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，使大豆蛋白得以降解的同時(shí)賦予蛹蟲草的其他活性物質(zhì)于發(fā)酵菌質(zhì)之中，產(chǎn)生具有抗氧化活性的代謝產(chǎn)物，即“二次生理活性成分”[22]，使兩者的功效得到充分地發(fā)揮和互補(bǔ)。通過研究大豆在發(fā)酵過程中發(fā)酵菌質(zhì)的蛋白質(zhì)、氨基酸、蟲草素含量變化情況和對發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化能力進(jìn)行跟蹤，研究發(fā)酵菌質(zhì)的主要成分和抗氧化活性的變化規(guī)律，為進(jìn)一步綜合開發(fā)和高值化利用蛹蟲草和大豆資源、提高功能性產(chǎn)品質(zhì)量、增加產(chǎn)品種類和經(jīng)濟(jì)效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草（Cordyceps militaris）14號菌株：江蘇省食品生物加工工程技術(shù)研究中心保藏菌種；大豆（Giycine max）（淮豆12號）：徐州大潤發(fā)超市。

三羥甲基氨基甲烷（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品：成都德思特生物技術(shù)有限公司；鄰苯三酚：南京化學(xué)試劑股份有限公司；抗壞血酸：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；鄰二氮菲：無錫亞泰聯(lián)合化工有限公司；Tris－HCl緩沖液：青島捷世康生物科技有限公司；三氯乙酸：上海宏瑞化工有限公司；冰乙酸：山東佰仟化工有限公司；乙酸鈉、茚三酮：濟(jì)南蕭試化工有限公司；丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；過氧化氫：江西鑫隆醫(yī)藥保健品有限公司。

50 mmol/L 鄰苯三酚；Tris－HCl緩沖液：50 mmol/L，pH8.2；0.75 mol/L，pH7.4 磷酸鹽緩沖液；10 mmol/L 鄰二氮菲溶液；7.5 mmol/L FeSO4溶液；0.1%H2O2溶液；3 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液；0.2 mol/L pH5.4乙酸－乙酸鈉緩沖溶液；2%茚三酮顯色液；0.1%抗壞血酸溶液。以上溶液均為試驗(yàn)中配制。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基——薩氏培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar with yeast extract，SDAY）：葡萄糖 4%、蛋白胨 1%、酵母浸膏1%、瓊脂2%。

液體種子培養(yǎng)基——薩氏液體培養(yǎng)基（sabouraud dextrose with yeast extract，SDY）：去掉瓊脂的薩氏培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基——大豆固體培養(yǎng)基：大豆洗凈后加20℃清水浸泡6 h～8 h，去掉水，上面覆蓋3層濕潤紗布于20℃恒溫箱保溫，每8小時(shí)～12小時(shí)用清水浸泡3 min～5 min后繼續(xù)恒溫箱保溫，待有胚芽露出為止，以100 g每瓶分裝，加塞滅菌后備用。

1.3 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；UV7504紫外可見分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；LGJ－18A型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；80－3數(shù)顯臺式低速離心機(jī)、HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；HYG旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；HH.B11.600－S－Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；旭曼800Y粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司；40目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩：光亮篩具總廠；SH220石墨消解儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；SHZ－D（III）循環(huán)水式真空泵：上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司；R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申生科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)方法

種子制備：將保藏的蛹蟲草菌種置于22℃的恒溫培養(yǎng)箱中活化后接種到SDAY固體斜面中，22℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，轉(zhuǎn)接斜面菌種至液體種子培養(yǎng)基中（裝液量200 mL/500 mL三角瓶），23℃，150 r/min，培養(yǎng) 5 d～7 d。

固體發(fā)酵：在超凈工作臺中將三角瓶中培養(yǎng)好的液體種子的菌絲球打碎，吸取種子液10 mL，均勻加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的玻璃瓶中，使種子液與大豆充分混勻，用滅菌保鮮膜將玻璃瓶口封好，置于22℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

凍干處理：將固體發(fā)酵的大豆定期取樣1次，放入冰箱中進(jìn)行預(yù)冷凍，然后進(jìn)行真空冷凍干燥。

樣品處理：將凍干的樣品用粉碎機(jī)粉碎，過40目篩子后裝入塑料袋中，貼好標(biāo)簽并置于干燥器中待用。

空白對照處理：將未接種的大豆置于培養(yǎng)箱中同條件培養(yǎng)，處理方法與樣品相同。

1.4.2 總氮測定

采用凱氏定氮法測定總氮[23]。

稱取1 g樣品于石墨消解儀的消化管里，分別依次稱取加入 1 g K2SO4，0.5 g CuSO4，20 mL 濃硫酸攪拌均勻后進(jìn)行消化處理。直至管內(nèi)液體變?yōu)榈G色透明液體為止，待處理液完全冷卻后取出，在100 mL容量瓶中定容，搖勻后用凱氏定氮法測定。

總氮計(jì)算：

式中：x為樣品中氮含量，g/100 g；V1為樣品滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2為空白滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V3為測定樣品時(shí)消化液的體積，mL；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；14.008為每摩爾氮原子質(zhì)量，g/mol；m為樣品的質(zhì)量，g；F為氮轉(zhuǎn)化系數(shù)，6.25。

1.4.3 非蛋白氮測定

采用三氯乙酸法測定非蛋白氮。

稱取1 g待測樣品粉末，加入100 mL蒸餾水振蕩30 min后加入20 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后靜置25 min～35 min，過濾，濾渣再用三氯乙酸浸淋3次，收集濾液，將收集好的濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，將樣品加入石墨消解儀的消化管里消化，消化后用凱氏定氮法測定?？瞻讓φ諡? mL蒸餾水，處理方法同樣品。

1.4.4 蛋白質(zhì)含量計(jì)算

蛋白含量為總氮去掉非蛋白氮。

蛋白質(zhì)含量/g=總氮含量（g）－無機(jī)氮含量（g）

1.4.5 氨基酸測定

采用茚三酮方法[24－27]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液于6支試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，再加入1 mL乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，1 mL茚三酮顯色液，0.1 mL 0.1%的抗壞血酸溶液，充分混勻后蓋住試管口，于100℃沸水浴中加熱15 min，取出后迅速用自來水冷卻，靜置5 min，加入3 mL 60%乙醇稀釋，并充分搖勻，最后分光光度計(jì)于570 nm處測其吸光度，以A570為縱坐標(biāo)，氨基酸含量為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.128 6x-0.009 6，R2=0.997 5。

樣品處理：精確稱取干燥粉碎過的樣品粉末1 g，在90℃的水浴鍋中，以1∶20（g/mL）的料液比，用乙酸振蕩提取5 h，然后加5 mL 10%三氯乙酸溶液，振蕩1 min后靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)過濾定容至50 mL即得待測樣品。取其中濾液1 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定570 nm下吸光值A(chǔ)570。

氨基酸含量的計(jì)算：

通過氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到濾液中測定的氨基酸溶液濃度，然后按公式計(jì)算氨基酸含量。

1.4.6 蟲草素含量測定

樣品預(yù)處理：精確稱取大豆發(fā)酵菌質(zhì)樣品干粉1 g，定容至10 mL，超聲波處理30 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液3次處理后合并濾液，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取1 mL濾液定容至10 mL容量瓶待測。

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)液：將500 mg/mL的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成 0、5、10、15、20、25 μg/mL 蟲草素標(biāo)準(zhǔn)液，用高效液相色譜儀進(jìn)行測定?；貧w方程為y=328.58x-53.45，R2=0.997。

蟲草素的測定方法：使用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。色譜柱：Waters C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：15%甲醇+水；流速 1 mL/min；柱溫：20℃；紫外檢測波長 260 nm，10 μL 進(jìn)樣。

1.4.7 抗氧化活性測定

樣品制備：準(zhǔn)確定量稱取凍干樣品以及空白對照樣品，分兩組以料液比1∶20（g/mL）分別加入蒸餾水和95%乙醇，蓋緊棉塞，防止酒精蒸發(fā)。然后在25℃，200 r/min條件下振蕩提取24 h后，4 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行測定。

1.4.7.1 超氧陰離子自由基（·O2-）的清除率測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定[28]。

將Tris-HCl緩沖液和鄰苯三酚溶液分別在25℃水浴鍋保溫10 min備用。準(zhǔn)確吸取5 mL保溫后的Tris-HCl緩沖液，加入5 μL鄰苯三酚溶液，搖勻，以Tris-HC1緩沖液做參比，在325 nm下立即測定吸光度，每隔0.5分鐘測定其吸光度，取3.5 min測定的平均值計(jì)算，記為A0；樣品管取25℃水浴保溫10 min的Tris-HCl緩沖液5 mL，加入待測樣品液20 μL，再加入5 μL鄰苯三酚溶液，搖勻后同上操作測定，記為A1。

抑制率計(jì)算：抑制率/%=[（A0-A1）/A0]×100

1.4.7.2 羥自由基（·OH）的清除率測定

采用Fenton法測定[29]。

準(zhǔn)確吸取磷酸鹽緩沖液1 mL，鄰二氮菲溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加適量蒸餾水混勻后，加入FeSO4溶液1 mL定容至10 mL，此為未損傷反應(yīng)。另一10 mL容量瓶中加入上述試劑后，再加入H2O2溶液1 mL定容，為損傷反應(yīng)。樣品容量瓶在加入損傷反應(yīng)的物質(zhì)后，繼續(xù)加入1 mL樣品溶液并定容。上述定容后的溶液立即放入37℃水浴鍋中反應(yīng)90 min以上，然后在510 nm處以蒸餾水為參比測量其吸光值A(chǔ)510。

羥自由基清除率（D）計(jì)算：

D/%=[A510（樣品試液）-A510（損傷）]/[A510（未損傷）-A510（損傷）]×100

1.5 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)平行測定3個(gè)樣品，采用Excel 2013和IBM SPSS Statistics 19數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量變化

大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)的變化情況如圖1所示。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量的變化Fig.1 Variations of the protein contents in soybean substrate during solid-state fermentation

從圖1可以看出，大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量隨發(fā)酵時(shí)間而出現(xiàn)先降低然后升高最后再降低的峰形動態(tài)變化。經(jīng)方差分析，不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵菌質(zhì)蛋白質(zhì)含量具有顯著性差異（P＜0.01）。發(fā)酵開始4 d內(nèi)，蛋白質(zhì)含量逐漸降低，然后逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵到16d時(shí)，蛋白質(zhì)含量最高達(dá)到29.72 g/100 g，然后蛋白質(zhì)含量隨之下降，發(fā)酵28d時(shí)，蛋白質(zhì)含量最低達(dá)到6.29g/100g。在大豆發(fā)酵至16 d時(shí)，大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量是發(fā)酵開始時(shí)的2.58倍，試驗(yàn)表明，蛹蟲草可以提高大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量。

2.2 大豆發(fā)酵菌質(zhì)中氨基酸含量變化

大豆發(fā)酵菌質(zhì)中氨基酸含量的變化情況如圖2所示。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間大豆發(fā)酵菌質(zhì)中氨基酸含量的變化Fig.2 Variations of the amino acid contents in soybean substrate during solid-state fermentation

從圖2可以看出，大豆發(fā)酵菌質(zhì)中氨基酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸增加，然后逐步降低。經(jīng)方差分析，不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵菌質(zhì)氨基酸含量具有顯著性差異（P＜0.01），發(fā)酵初期氨基酸含量基本保持不變，發(fā)酵第7天以后，發(fā)酵菌質(zhì)中的氨基酸含量開始緩慢增加，發(fā)酵28 d時(shí)的氨基酸含量最高達(dá)到5.133 mg/g，比發(fā)酵開始時(shí)增加38.28%，可見，蛹蟲草可以使大豆蛋白得以較好的轉(zhuǎn)化。

2.3 大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素含量變化

大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素含量的變化情況如圖3所示。

圖3 大豆發(fā)酵菌質(zhì)中不同發(fā)酵時(shí)間蟲草素含量Fig.3 Variations of the cordycepin contents in soybean substrate during solid-state fermentation

從圖3可知，大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而呈現(xiàn)動態(tài)變化，在發(fā)酵21天前，蟲草素含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增加，發(fā)酵21 d時(shí)發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素含量最高達(dá)到216.7 μg/g，然后蟲草素含量逐漸減少。

2.4 大豆發(fā)酵菌質(zhì)提取液抗氧化活性變化

2.4.1 大豆發(fā)酵菌質(zhì)提取液超氧陰離子自由基（·O2-）清除能力的變化

不同發(fā)酵時(shí)間大豆發(fā)酵菌質(zhì)水提取液和乙醇提取液超氧陰離子自由基的清除能力情況如圖4所示。

由圖4可知，大豆發(fā)酵菌質(zhì)水提液和醇提液對超氧陰離子自由基清除能力的變化均是先降低再升高最后再降低的趨勢。水提液在第9天時(shí)對超氧陰離子自由基的清除率最低為38.03%，第21天時(shí)達(dá)到最高為53.76%，然后清除超氧自由基的能力逐步降低，到30 d時(shí)清除率為46.83%。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間大豆發(fā)酵菌質(zhì)提取液對超氧陰離子自由基的清除率Fig.4 Variations of the scavenging rate of superoxide anion free radical of the extracts in soybean substrate during solid-state fermentation

大豆發(fā)酵菌質(zhì)95%乙醇提取液在發(fā)酵前3天逐漸降低，然后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，清除自由基的清除率逐步增加，發(fā)酵到21 d時(shí)，對超氧陰離子自由基清除率最高達(dá)到48.13%，然后開始下降，當(dāng)發(fā)酵到30 d時(shí)超氧陰離子自由基清除率下降到最低39.86%，但比發(fā)酵前的27.54%提高44.73%。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，大豆發(fā)酵菌質(zhì)水提液具有較好的清除超氧自由基的能力。

2.4.2 大豆發(fā)酵菌質(zhì)提取液對羥自由基（·OH）清除能力的變化

大豆發(fā)酵菌質(zhì)不同時(shí)間水提液和乙醇提取液對羥自由基的清除能力如圖5所示。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間大豆發(fā)酵菌質(zhì)提取液對羥自由基的清除率Fig.5 Variations of the scavenging rate of hydroxyl radical of the extracts in soybean substrate during solid-state fermentation

由圖5可知，蛹蟲草固體發(fā)酵大豆菌質(zhì)不同時(shí)間水提液和乙醇提取液對羥自由基均有較好的清除能力，且清除率的變化情況是先降低，然后升高，最后再降低。水提液在發(fā)酵第3天對羥自由基的清除率降到最低，到21 d時(shí)達(dá)到最大為68.75%，比開始發(fā)酵時(shí)提高49.39%，當(dāng)發(fā)酵到30 d時(shí)，對羥自由基的清除率下降到61.56%，但仍然比發(fā)酵開始時(shí)46.02%高33.77%。

大豆發(fā)酵菌質(zhì)乙醇提取液對羥自由基清除率當(dāng)發(fā)酵第9天時(shí)降到最低72.27%，到發(fā)酵第21天時(shí)達(dá)到最高95.07%，然后在發(fā)酵30 d時(shí)減小到91.31%，且清除率仍比發(fā)酵前提高13.75%。試驗(yàn)結(jié)果顯示，大豆發(fā)酵菌質(zhì)的乙醇提取液具有較好的羥自由基的清除能力。

3 討論

利用蛹蟲草對大豆進(jìn)行固體發(fā)酵，其發(fā)酵菌質(zhì)中主要化學(xué)成分和抗氧化活性發(fā)生變化，是由于大豆在發(fā)酵過程中，在微生物酶的作用下，通過一系列的反應(yīng)使大豆內(nèi)源組分分子結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)等發(fā)生改變而產(chǎn)生一些新的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)由于微生物的代謝作用也產(chǎn)生一些特殊的代謝產(chǎn)物，并賦予大豆發(fā)酵產(chǎn)品新的營養(yǎng)功能[30-33]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，大豆經(jīng)發(fā)酵后其發(fā)酵菌質(zhì)中蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先降低再升高，最后再降低的趨勢，主要是由于發(fā)酵初期蛹蟲草產(chǎn)生的酶對蛋白質(zhì)進(jìn)行分解以維持菌體生長代謝所致，發(fā)酵中期蛋白質(zhì)含量增加是由于蛹蟲草進(jìn)行生長代謝而進(jìn)行的二次合成的緣故，發(fā)酵后期蛋白含量減少是由于菌體后期菌絲生長停止或細(xì)胞自溶導(dǎo)致各種分解酶類釋放，使發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行分解而導(dǎo)致的。本試驗(yàn)結(jié)果與彭志妮等[16]利用蛹蟲草對大豆進(jìn)行發(fā)酵研究結(jié)果顯示的發(fā)酵基質(zhì)蛋白酶活性變化規(guī)律相符。

大豆發(fā)酵菌質(zhì)中氨基酸含量的變化趨勢是先隨發(fā)酵時(shí)間的增加而逐漸增加，然后達(dá)到峰值，最后逐漸降低。氨基酸主要由蛋白水解或氨基酸代謝而產(chǎn)生，由于蛹蟲草的蛋白酶活性在發(fā)酵過程中不斷提高，導(dǎo)致游離氨基酸量多于菌體生長所需而產(chǎn)出氨基酸積累，使氨基酸含量在發(fā)酵過程中不斷增加，發(fā)酵后期由于菌體代謝活力減弱，蛋白質(zhì)降解能力降低，菌體代謝所需的脫氨作用、轉(zhuǎn)氨作用、聯(lián)合脫氨或脫羧作用分解為α-酮酸、胺類及二氧化碳等而導(dǎo)致氨基酸數(shù)量減少，這一試驗(yàn)結(jié)果與顧泉等[34]對食用真菌發(fā)酵豆?jié){過程中氨基酸含量變化研究結(jié)果一致。

大豆發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素含量變化趨勢與氨基酸含量變化一致，這是因?yàn)橛枷x草在發(fā)酵大豆基質(zhì)過程中利用大豆的營養(yǎng)成分進(jìn)行生長代謝，產(chǎn)生蟲草素并不斷積累賦予大豆發(fā)酵菌質(zhì)之中。本試驗(yàn)蟲草素測定結(jié)果高于普通蛹蟲草單獨(dú)發(fā)酵，與閆梅霞等[19]對蛹蟲草固態(tài)發(fā)酵人參產(chǎn)物的有效成分含量測定試驗(yàn)結(jié)果相似。

已有研究表明大豆發(fā)酵后可以增加其抗氧化能力[35]，本研究結(jié)果表明大豆發(fā)酵菌質(zhì)水提液和醇提液均具有一定的清除超氧自由基和羥自由基能力，但兩者清除超氧自由基和羥自由基的效果不同，且受發(fā)酵時(shí)間影響。發(fā)酵菌質(zhì)水提液清除超氧自由基能力大于乙醇提取液，表明水提液含有大量的大豆分解和重組所產(chǎn)生的及蛹蟲草代謝所產(chǎn)生的極性抗氧化物質(zhì)，如多糖、酶類（超氧化物歧化酶superoxide dismutase,SOD）、蟲草素等親水物質(zhì)[16，36]。發(fā)酵菌質(zhì)乙醇提取液清除羥自由基的能力高于水提液，且大于清除超氧自由基的能力，這可能與酚類物質(zhì)含量和種類不同有關(guān)，這與Cho和Kim的研究結(jié)果一致[37-38]。

4 結(jié)論

大豆經(jīng)蛹蟲草固體發(fā)酵后，其發(fā)酵菌質(zhì)中主要成分發(fā)生了較大變化，呈現(xiàn)出不同步狀態(tài)，但均出現(xiàn)峰值，各種物質(zhì)的變化受發(fā)酵時(shí)間影響，發(fā)酵菌質(zhì)氨基酸、蟲草素含量增加，抗氧化活性增強(qiáng)。發(fā)酵菌質(zhì)含有蛹蟲草菌絲體和蟲草素等活性代謝產(chǎn)物，氨基酸含量增加，有利于人體消化吸收利用，具有豐富的營養(yǎng)和生理功能，本研究表明蛹蟲草大豆發(fā)酵菌質(zhì)具有良好的開發(fā)功能性食品原料和抗氧化食品的潛力。