郭曉燕，王英臣，2，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101；2.吉林省釀造技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林吉林132101）

山核桃（Carya cathayensis Sarg.）是一種落葉喬木，屬胡桃科。內(nèi)含豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、預(yù)防神經(jīng)退變和提高記憶等功能[1]。但由于山核桃含有一層薄皮，薄皮中含有很多的多酚類(lèi)物質(zhì)[2]，所以在食用時(shí)會(huì)有很大的苦澀味，無(wú)法將其應(yīng)用于食品，目前只能將其用作飼料，使山核桃粕的再利用受到了很大地限制[3]。

山核桃粕中除去大部分油脂以后，仍含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其中有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白，經(jīng)過(guò)發(fā)酵以后會(huì)含有豐富的氨基酸，對(duì)人體有益，山核桃粕中還含有豐富的無(wú)機(jī)鹽和維生素，例如：鈣、磷、鐵、核黃素、維生素 B6等[2]。

本研究主要采用篩分的方法，來(lái)提高山核桃粕中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的價(jià)值。經(jīng)過(guò)發(fā)酵山核桃粕和黃豆，使原料中的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解出來(lái)，加工過(guò)程中加入多種微生物菌種進(jìn)行發(fā)酵，會(huì)產(chǎn)生豐富的酶系，在多種酶系的作用下生成醇類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪、雜環(huán)化合物等呈香物質(zhì)，賦予了醬品更多營(yíng)養(yǎng)、更好風(fēng)味的特點(diǎn)。并且很好的將山核桃中的優(yōu)質(zhì)蛋白結(jié)合到醬品中，從而將山核桃的功能賦予發(fā)酵醬，使大醬的功能更加廣泛。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

山核桃粕：吉林省樺甸市吉元土產(chǎn)有限公司。

黃豆、面粉、食鹽：市售。

米曲霉（滬釀3.042）、米根霉、黑曲霉、毛霉菌、枯草芽孢桿菌、生香酵母、乳酸菌：山東沂源康源生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海東麓儀器設(shè)備有限公司；ST-02A型100克多功能粉碎機(jī)：上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩（60、80、100、120、140目）：浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；MJ-250數(shù)顯霉菌培養(yǎng)箱：江蘇省金壇市正基儀器有限公司；CP1502分析天平：上海恒剛儀器儀表有限公司；HH-1水浴鍋：常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器場(chǎng)；容量瓶、移液管、堿式滴定管（50 mL）、三角瓶：滄州津玻實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；V-5000紫外線分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；ORP800 pH計(jì)：武漢吉爾德科技有限公司；鐵架臺(tái)：天長(zhǎng)市天滬分析儀器有限公司。

2 工藝流程及操作要點(diǎn)

2.1 工藝流程

2.2 操作要點(diǎn)

2.2.1 原料預(yù)處理

1）山核桃的干燥：挑選完整的、沒(méi)有被蟲(chóng)害污染的山核桃粕置于干燥箱中干燥，溫度設(shè)定55℃，時(shí)間50 min，除去多余水分，變?yōu)榈S色為止。

2）大豆清洗：選取顆粒完整、無(wú)皺皮、表面有光澤的大豆進(jìn)行清洗，除去表面灰塵，后將水瀝干。

2.2.2 破碎

1）山核桃粕的破碎與篩分：將干燥的山核桃粕放入多功能粉碎機(jī)中粉碎，粉碎后過(guò)100目篩進(jìn)行篩分，取篩下物過(guò)100目篩[4]。

2）大豆的破碎：將瀝干的大豆，放入粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎成粉末狀。

2.2.3 蒸料

將粉碎過(guò)篩后的山核桃粕與大豆按質(zhì)量比分別為 4 ∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8 ∶2混合，加入大豆與山核桃粕總量10%的熟面粉[5]?；旌虾玫脑戏诺诫姶艩t上進(jìn)行常壓蒸料，在2 200 W下蒸5 min，再換到800 W蒸20 min，至原料熟爛，具有香味即可。

2.2.4 制曲

將米曲霉、黑曲霉、毛霉、枯草芽孢桿菌按2∶1∶1∶1的質(zhì)量比混合[6]，配制成混合菌種，并按0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%的添加量與蒸后冷卻的原料混合，加入總量65%的無(wú)菌水，拌勻，捏成蠶豆大的丸曲裝入竹匾內(nèi)平鋪，移入霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別設(shè)置溫度為 20、25、30、35、40℃，保持 80%的濕度。培養(yǎng)18 h左右，曲料上呈現(xiàn)白色菌絲，同時(shí)產(chǎn)生曲香。在培養(yǎng)過(guò)程中，每隔3小時(shí)向紗布上噴灑無(wú)菌水，隨時(shí)進(jìn)行翻曲以防曲料結(jié)塊，減少通風(fēng)阻力，降低曲料溫度。曲料表面呈新鮮淡黃綠色，內(nèi)部很松散，翻動(dòng)時(shí)有揮飛的孢子，這時(shí)制曲完成。

2.2.5 發(fā)酵

將成品丸曲打散，放入土陶制的壇子中，用手按壓實(shí)。放置自然升溫，當(dāng)溫度上升至40℃時(shí)，進(jìn)行翻醬。當(dāng)溫度持續(xù)上升，將60℃，濃度為14.5°Bé的鹽水按曲的80%、100%、120%、140%、160%加入到原料曲中，等鹽水慢慢滲入其中，在表面撒薄薄一層細(xì)鹽，進(jìn)行封蓋[7]。密封保存，分別維持發(fā)酵溫度為23、26、29、32、35℃，每天檢查2次溫度，進(jìn)行升溫和降溫維持溫度相對(duì)穩(wěn)定。發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為 17、19、21、23、25 d，待丸曲完全被分解成粘稠的半固態(tài)，且測(cè)定氨基態(tài)氮含量大于0.5%時(shí)，醬醅即成熟[8]，此時(shí)補(bǔ)加24°Bé鹽水，翻醬溶解食鹽。

2.2.6 后熟發(fā)酵

放置土陶壇子中進(jìn)行后熟發(fā)酵，溫度控制20℃，時(shí)間一個(gè)月左右，即山核桃粕發(fā)酵醬發(fā)酵完成，此時(shí)醬品口感細(xì)膩，醬香及酯香柔和，具有淡淡的山核桃味。

2.2.7 調(diào)醬、殺菌

成品醬根據(jù)口感、滋味的不同可進(jìn)行調(diào)配。將密封好的已經(jīng)發(fā)酵完成的成品醬，放入85℃的水浴鍋中進(jìn)行殺菌，維持15 min。

2.3 分析檢測(cè)方法

2.3.1 樣品處理

1）粗酶液的制備

取10 g成曲于研缽中研細(xì)，后定容至100 mL，在40℃水浴鍋中水浴1 h（用玻璃棒不停攪拌），用紗布過(guò)濾獲得濾液。

2）醬樣品的制備

將成品醬攪拌均勻，若有顆粒，可用研缽研細(xì)。取樣品5.0 g，用50mL80℃左右蒸餾水分3次洗入100mL容量瓶中，并加水至刻度，混勻后過(guò)濾，濾液即為待測(cè)樣品。

2.3.2 曲中蛋白酶活力的測(cè)定

采用SB/T10317－1999《蛋白酶活力的測(cè)定方法》：福林法進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定[9]。

2.3.3 醬中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

參照GB/T5009.235－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》酸度計(jì)法對(duì)成品醬進(jìn)行氨基態(tài)氮含量的測(cè)定[10]。

2.3.4 成曲的感官評(píng)定

由感官評(píng)定小組對(duì)成品曲進(jìn)行評(píng)分（10分制），將各分值進(jìn)行匯總?cè)∑骄?，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 成品曲感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria for soy sauce koji

2.3.5 成品醬的感官評(píng)定

由感官評(píng)定小組對(duì)成品發(fā)酵醬進(jìn)行評(píng)分（10分制），將各分值進(jìn)行匯總?cè)∑骄?，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 成品醬的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria for sauce

續(xù)表2 成品醬的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Continue table 2 Sensory evaluation criteria for sauce

3 結(jié)果與分析

3.1 醬曲的制備

3.1.1 山核桃粕添加量對(duì)曲的影響

在混合菌種的添加量為0.2%，制曲溫度為30℃的條件下，研究山核桃粕添加量對(duì)醬曲的感官和蛋白酶活力的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 原料質(zhì)量比對(duì)曲感官評(píng)分的影響Fig.1 The influence of raw material ratio on the sensory evaluation of soy sauce koji

圖2 原料質(zhì)量比對(duì)曲蛋白酶活力的影響Fig.2 The influence of raw material ratio on the activity of protease

由圖1可以看出，隨著山核桃粕量的增加，成品曲的感官評(píng)價(jià)越來(lái)越好，試驗(yàn)中成品曲呈新鮮黃綠色，具有醬香和酯香，質(zhì)地松軟，菌絲均勻生長(zhǎng)，當(dāng)原料質(zhì)量比為6∶4時(shí)，感官評(píng)分最高，繼續(xù)添加山核桃粕，成品曲的顏色變暗，試驗(yàn)中成品曲體現(xiàn)出異味，通過(guò)試驗(yàn)確定在6∶4的比例時(shí)，醬曲感官評(píng)分最高。

由此可以看出原料質(zhì)量比在6∶4時(shí)，曲的蛋白酶活力達(dá)到最高峰，后隨著原料質(zhì)量比的增大，蛋白酶活力降低。

綜合考慮，選原料質(zhì)量比為 5∶5、6∶4、7∶3作為該因素的3個(gè)水平。

3.1.2 混合菌種添加量對(duì)曲的影響

在原料質(zhì)量比為6∶4，制曲溫度為30℃的條件下，研究混合菌種的添加量對(duì)醬曲的感官和蛋白酶活力的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 混合菌種的添加量對(duì)成曲的影響Fig.3 The influence of the addition of mixed strains on the composition

由圖3可以看出，隨著混合菌種添加量的增加，成品曲的感官評(píng)價(jià)越來(lái)越好，試驗(yàn)中成品曲呈新鮮黃綠色，具有濃郁的醬香和酯香，曲子酥軟，菌絲深入曲中，當(dāng)混合菌種添加量增加到0.20%時(shí)，感官評(píng)分最高，隨著混合菌種添加量的繼續(xù)增加，成品曲的顏色變暗，試驗(yàn)中成品曲體現(xiàn)出異味。

圖4 混合菌種添加量對(duì)成曲蛋白酶活力Fig.4 The effect of the addition of mixed strains on the activity of protease

由4圖可以看出，隨著混合菌種添加量的增大，曲中蛋白酶活力增大，在0.20%時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最高峰。分析其中的原因可能是，不同的菌種之間存在相互抑制，具體的抑制關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

綜合考慮，選擇混合菌種的添加量分別為0.15%、0.20%和0.25%這3個(gè)水平進(jìn)行后期正交試驗(yàn)。

3.1.3 制曲溫度對(duì)曲的影響

在混合菌種的添加量為0.2%，原料質(zhì)量比為6∶4的條件下，研究山核桃粕添加量對(duì)醬曲的感官和蛋白酶活力的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 溫度對(duì)曲感官評(píng)分的影響Fig.5 Influence of temperature on the sensory score of the soy sauce koji

由圖5可以看出，隨著制曲溫度的升高，成品曲的感官評(píng)價(jià)趨于平和，試驗(yàn)中成品曲呈新鮮黃綠色，具有醬香和酯香，質(zhì)地松軟，菌絲均勻生長(zhǎng)，當(dāng)制曲溫度升高到30℃時(shí)，感官評(píng)分最高。

圖6 制曲溫度對(duì)曲蛋白酶活力的影響Fig.6 The influence of curve temperature on the activity of protease

由圖6可知，曲中蛋白酶活力隨著制曲溫度的升高而增大，曲的蛋白酶活力在35℃時(shí)達(dá)到最高峰，之后溫度再升高蛋白酶活力降低。25℃到35℃，這個(gè)溫度范圍很適合微生物生長(zhǎng)，選擇25、30℃和35℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

3.1.4 正交試驗(yàn)

3.1.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)2.2.4進(jìn)行制曲工藝的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的因素水平表見(jiàn)3。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Orthogonal experimental factor level table

3.1.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental results

從正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出：A2B1C2條件下，蛋白酶活力最高為413 U/g。由極差R可以得出3個(gè)因素的主次順序?yàn)镃>A>B，即溫度對(duì)制曲的影響最大，其次是原料質(zhì)量比。在極差分析下，最優(yōu)工藝條件為A2B3C2，即原料質(zhì)量比為6∶4、混合菌種的添加量為0.25%、制曲溫度為30℃。

在A2B3C2確定的工藝條件下對(duì)成品曲進(jìn)行感官評(píng)定和蛋白酶活力的測(cè)定。此時(shí)的成品曲呈新鮮黃綠色，具有曲香，質(zhì)地疏松，感官評(píng)分為8.2分，評(píng)分較高。此時(shí)測(cè)定的蛋白酶活力為418 U/g，高于A2B1C2工藝條件下的蛋白酶活力。所以，最終確定的工藝為

3.2 山核桃粕發(fā)酵醬的制備

3.2.1 鹽水添加量對(duì)成品醬質(zhì)量的影響

在發(fā)酵溫度為29℃，發(fā)酵時(shí)間為21 d的條件下，研究食鹽水添加量對(duì)發(fā)酵醬的感官和氨基態(tài)氮含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。

圖7 食鹽水添加量對(duì)醬感官評(píng)分的影響Fig.7 The effects of salt water addition on sensory grading of sauces

由圖7可以看出，隨著食鹽水添加量的增加，成品醬的感官評(píng)價(jià)越來(lái)越好，試驗(yàn)中成品醬呈棕褐色，具有醬香和酯香，當(dāng)食鹽水的添加量增加到原料曲的120%時(shí)，感官評(píng)分最高，隨著食鹽水添加量的繼續(xù)增加，成品醬的顏色變深，試驗(yàn)中成品醬口味咸澀。

圖8 食鹽水添加量對(duì)氨基態(tài)氮的含量影響Fig.8 The effects of salt water addition on amino nitrogen content

由圖8可知，隨著食鹽水添加量的增加，氨基態(tài)氮的含量增加，當(dāng)添加量到120%時(shí)，氨基態(tài)氮含量最高，達(dá)到1.12 g/100 g，之后隨著食鹽水添加量的繼續(xù)增加，氨基態(tài)氮含量下降?？赡苁且?yàn)槭雏}水抑制了菌種的發(fā)酵。

綜合考慮，選擇100%、120%和140%為食鹽水添加量這一因素的3個(gè)水平。

3.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)成品醬質(zhì)量的影響

在食鹽水添加量為120%，發(fā)酵時(shí)間為21 d的條件下，研究發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵醬的感官和氨基態(tài)氮含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9、圖10。

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)醬感官評(píng)分的影響Fig.9 The influence of fermentation temperature on sensory grading of sauces

由圖9可以看出，隨著發(fā)酵溫度的升高，成品醬的感官評(píng)價(jià)越來(lái)越好，試驗(yàn)中成品醬呈棕褐色，具有濃郁的醬香和酯香，當(dāng)發(fā)酵溫度在29℃時(shí)，感官評(píng)分最高，隨著發(fā)酵溫度的繼續(xù)升高，成品醬的顏色變暗，失去色澤，試驗(yàn)中成品醬口感較差。

圖10 發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.10 The influence of fermentation temperature on amino nitrogen content

由圖10看出：隨著發(fā)酵溫度的提高，氨基態(tài)氮的含量增加，當(dāng)溫度達(dá)到26℃時(shí)，氨基態(tài)氮含量最高，達(dá)到1.03 g/100 g，之后隨著發(fā)酵溫度的繼續(xù)提高，氨基態(tài)氮含量下降。

綜合考慮，選取發(fā)酵溫度為26、29℃和32℃為該因素的3個(gè)水平。

3.2.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

在食鹽水添加量為120%，發(fā)酵時(shí)間為21 d的條件下，研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵醬的感官和氨基態(tài)氮含量的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11、圖12。

由圖11可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，成品醬的感官評(píng)價(jià)越來(lái)越好，試驗(yàn)中成品醬呈棕褐色，具有光澤，并且有濃郁的醬香和酯香，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)到21 d時(shí)，感官評(píng)分最高，后來(lái)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，成品醬的顏色變深，感官評(píng)分較差。

圖11 發(fā)酵時(shí)間對(duì)醬感官評(píng)分的影響Fig.11 The influence of fermentation time on sensory grading of sauces

圖12 發(fā)酵時(shí)間對(duì)醬中氨基態(tài)氮含量的影響Fig.12 The influence of fermentation time on the content of amino nitrogen in the sauce

由圖12可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)成品醬的氨基態(tài)氮含量在21 d時(shí)達(dá)到最高，之后隨著天數(shù)的延長(zhǎng)，氨基態(tài)氮的含量逐漸降低。分析造成這種現(xiàn)象的基本原因：制曲產(chǎn)生了豐富的酶系，在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮了作用，分解了蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，隨著時(shí)間的遞增原料中大分子被消耗，而產(chǎn)生醇、酸和酯等產(chǎn)物逐漸積累，會(huì)影響醬的品質(zhì)，產(chǎn)生異味，酸敗等現(xiàn)象。

綜合考慮，選擇發(fā)酵時(shí)間為19、21 d和23 d為該因素的3個(gè)水平。

3.2.4 正交試驗(yàn)

3.2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)2.2.5進(jìn)行制曲工藝的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的因素水平表見(jiàn)5。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表Table 5 Table of orthogonal experimental factors

3.2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental results

從正交試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看：在A3B3C2工藝條件下，氨基態(tài)氮含量為1.46 g/100 g；由極差R可以得出3個(gè)因?qū)Π被鶓B(tài)氮含量影響的主次順序?yàn)锳>B>C，即水料比對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響最大，其次是溫度。在方差分析下，所得的較優(yōu)工藝條件為A3B2C3，即食鹽水的添加量為曲的140%、發(fā)酵溫度為29℃、制曲時(shí)間為23 d。

在A3B2C3工藝條件下，制得成品發(fā)酵醬后進(jìn)行感官評(píng)定和氨基態(tài)氮含量的測(cè)定。此時(shí)的發(fā)酵醬呈棕褐色，具有光澤，還具有濃郁的醬香和酯香，口感細(xì)膩，感官評(píng)分為8.6分，感官評(píng)分較高。此時(shí)測(cè)定氨基態(tài)氮含量為1.47 g/100 g，高于A3B3C2條件下的氨基態(tài)氮含量。所以，選擇的較優(yōu)工藝為A3B2C3。

4 結(jié)論

通過(guò)研究確定了制曲工藝條件為：山核桃粕粉與黃豆質(zhì)量比為6∶4、混合菌種的添加量為0.25%，制曲溫度為30℃。此時(shí)，蛋白酶活力強(qiáng)，分解蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)，原料的利用率高。

以山核桃粕為主要原料，采用了多菌種發(fā)酵的方式，制得的具有山核桃風(fēng)味的發(fā)酵醬，增加了通過(guò)研究確定了發(fā)酵工藝條件為：添加食鹽水的量為曲料的140%、發(fā)酵溫度為29℃、發(fā)酵23 d。此時(shí)，成品醬的氨基態(tài)氮含量高，風(fēng)味物質(zhì)含量高，口感細(xì)膩，醬香及酯香柔和，具有淡淡的山核桃味。