方瑞娜，張婷婷，景靜，高峰青

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南開封475004；2.開封市綠色涂層材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封475004；3.國(guó)家安全生產(chǎn)監(jiān)督管理總局培訓(xùn)中心，北京100012）

十香菜，草本植物，即“留蘭香”。在民間具有廣泛的食用和藥用價(jià)值[1－2]。因其精油具有特殊的香味而用作牙膏、香皂、糖果、煙酒等調(diào)味香料[3－4]。目前，常見提取方法主要有溶劑提取法、超臨界CO2萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法[5－8]。其中溶劑提取法耗時(shí)較長(zhǎng)，操作繁瑣；超臨界CO2萃取法提取效率高，無(wú)污染，但其成本高，費(fèi)用貴；超聲波提取法提取時(shí)間短，簡(jiǎn)單易行，但易形成超聲空白區(qū)而影響提取效率；而微波輔助提取法耗時(shí)短，提取效率高，成本適中，因此成為目前研究的熱點(diǎn)[9－12]。黃酮的測(cè)定方法常見的有兩種[13－15]，其一因不能排除非黃酮類物質(zhì)的干擾而較少運(yùn)用；另一個(gè)穩(wěn)定性高且抗干擾能力強(qiáng)，是目前應(yīng)用較為廣泛的檢測(cè)方法[16－19]。因此，本研究選用微波輔助法進(jìn)行提取，采用亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉分光光度法檢測(cè)黃酮含量，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)相應(yīng)試驗(yàn)條件進(jìn)行探討，為十香菜的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

十香菜：河南；無(wú)水乙醇（分析純）：濟(jì)南嘉裕化工有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（分析純）：蘇州嘉鼎化學(xué)科技有限公司；過(guò)氧化氫、水楊酸、硫酸亞鐵（分析純）：河南雪弈生物科技有限公司；DPPH（分析純）：上海思域化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ISO9001超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；EU－2200R紫外可見分光光度計(jì)：上海添時(shí)科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

清洗十香菜，烘干，粉碎并過(guò)篩，裝瓶。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考馬金菊等[20]方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：移取不同體積蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于比色管中，依次加入試劑，30%乙醇定容，搖勻靜置。測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 黃酮類物質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱取樣品1.000 0 g，與不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇混合、攪拌并靜置15 min，選擇不同的液料比、微波功率、微波時(shí)間制得待測(cè)樣品提取液過(guò)濾后，30%乙醇定容。

1.3.4 黃酮類物質(zhì)提取率的計(jì)算

移取提取液至比色管中，測(cè)定吸光度。提取率計(jì)算公式如下：

式中：ρ為黃酮類物質(zhì)提取率，mg/g；C為黃酮質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)，mg/mL；V為黃酮提取液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 黃酮提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

設(shè)4個(gè)單因素（乙醇用量、微波時(shí)間、微波功率、液料比），考察對(duì)十香菜中黃酮提取率的影響。

1.3.6 優(yōu)化正交試驗(yàn)條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定最優(yōu)條件，設(shè)計(jì)四因素四水平正交試驗(yàn)，探索最佳試驗(yàn)參數(shù)。

1.3.7 十香菜黃酮抗氧化性實(shí)驗(yàn)

以DPPH自由基和·OH清除率來(lái)考察十香菜中黃酮的抗氧化性。

1.3.7.1 DPPH自由基的清除

參考金杜欣等[21]方法，配制DPPH溶液，無(wú)水乙醇做參比，測(cè)定吸光度。公式如下：

式中：Ai為DPPH溶液吸光度值；Ax為樣品液和DPPH溶液吸光度值；Ae為不含DPPH溶液時(shí)樣品液吸光度值。

1.3.7.2 ·OH的清除

參照賈之慎等[22－25]的方法，取不同體積分?jǐn)?shù)的樣品液，依次加入試劑，蒸餾水作參比，測(cè)定吸光度。公式如下：

式中：A0為生成的·OH溶液吸光度值；A1為樣品液和生成·OH溶液吸光度值；A2為樣品液吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

試驗(yàn)獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列方程為：y=9.2661x+0.0092，R2=0.999 3，該標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～0.01 mg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇用量對(duì)十香菜黃酮提取率的影響

乙醇用量對(duì)十香菜黃酮提取率的影響如圖2所示。

圖2 乙醇用量對(duì)十香菜黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of Percentage of ethanol content on the extraction rate of flavonoids from ten coriander

由圖2可以看出，乙醇用量在80%之前提取率表現(xiàn)為正相關(guān)，乙醇用量在80%時(shí)提取率最大，之后表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。推測(cè)乙醇用量太大，可能會(huì)溶出醇溶性雜質(zhì)脂類物質(zhì)。因此，乙醇用量選擇80%。

2.2.2 液料比對(duì)十香菜黃酮提取率的影響

液料比對(duì)十香菜黃酮提取率的影響如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)十香菜黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of flavonoids from ten coriander

由圖3可以看出，在液料比為50∶1（mL/g）之前提取率表現(xiàn)為正相關(guān)，之后表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，液料比為50∶1（mL/g）時(shí)提取率最大。因此，液料比選擇50 ∶1（mL/g）。

2.2.3 微波時(shí)間對(duì)十香菜黃酮提取率的影響

微波時(shí)間對(duì)十香菜黃酮提取率的影響如圖4所示。

由圖4得出，提取率隨著提取時(shí)間的增加表現(xiàn)為正相關(guān)，4 min時(shí)提取率最大，4 min后表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)。推測(cè)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致乙醇揮發(fā)較快。因此，微波時(shí)間確定為4 min。

圖4 微波時(shí)間對(duì)十香菜黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of microwave time on the extraction rate of flavonoids from ten coriander

2.2.4 微波功率對(duì)十香菜黃酮提取率的影響

微波功率對(duì)十香菜黃酮提取率的影響如圖5所示。

圖5 微波功率對(duì)十香菜黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the extraction rate of flavonoids from ten coriander

由圖5看出，提取時(shí)間增加提取率表現(xiàn)為正相關(guān)，在微波功率400 W時(shí)最高，微波功率繼續(xù)增大提取率表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，推測(cè)提取功率的增大促使乙醇揮發(fā)速率加快。因此，選擇微波功率為400 W。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

為選本試驗(yàn)的最佳條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素四水平正交試驗(yàn)，探索最佳試驗(yàn)參數(shù)，具體如表1所示。按照正交試驗(yàn)表2進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)表Table 1 Flavonoids extraction conditions optimization orthogonal test table

表2 黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for flavonoids extraction conditions optimization

試驗(yàn)結(jié)果表明，影響各因素的重要性為：A>D>C>B。最佳方案是A2D2C4B2，即乙醇用量為70%，微波時(shí)間3 min，液料比60∶1（mL/g），微波功率400 W。為進(jìn)一步驗(yàn)證該試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，依照上述試驗(yàn)條件重復(fù)提取5次進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如下：提取率分別為8.34%、8.38%、8.37%、8.35%、8.39%，得提取率平均值為8.37%，高于正交試驗(yàn)其他組合，因此該條件為正交優(yōu)化試驗(yàn)最佳條件，說(shuō)明此方案可實(shí)施性較強(qiáng)。

2.4 抗氧化能力測(cè)定結(jié)果分析

十香菜中黃酮類物質(zhì)以及VC對(duì)DPPH自由基、·OH影響見圖6和圖7。

由圖6和圖7可以看出，十香菜中黃酮類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除率最大達(dá)到89.70%，對(duì)·OH清除率最大達(dá)到82.49%，而VC清除率最大達(dá)到92.13%，證明二者均具有較好的抗氧化性，但其最高清除率均低于VC。

圖6 十香菜中黃酮VC對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of ten coriander and VCon DPPH free radica

圖7 十香菜中黃酮VC對(duì)·OH清除率Fig.7 Scavenging rate of ten coriander and VCon hydroxyl free radical

3 結(jié)論

1）本試驗(yàn)以十香菜為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)黃酮類成分進(jìn)行探討，確定最佳提取條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，影響提取因素的主次關(guān)系為，乙醇用量A>微波功率D>液料比C>微波時(shí)間B。最佳試驗(yàn)條件為：乙醇用量為 70%、微波時(shí)間 3min、液料比 60 ∶1（mL/g）、微波功率400 W，該條件下其提取率為8.37 mg/g。結(jié)果表明十香菜中黃酮類成分含量較高。

2）體外抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果表明，十香菜提取液對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)89.70%，對(duì)·OH清除率達(dá)到82.49%，表明十香菜中黃酮作為天然綠色抗氧化劑，具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，可以有效抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫能力，對(duì)細(xì)胞過(guò)氧化衰老具有一定抑制作用。