錢慧琴，秦晶晶，趙媛，王瑩，張學(xué)敏，閆福林，3，*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000；2.宜陽縣人民醫(yī)院，河南洛陽471000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000）

月季（Rosa chinensis Jacq.）為薔薇科薔薇屬常綠灌木，在我國大部分地區(qū)均有栽培，可供觀賞、食用和藥用[1]。入藥部位是花，傳統(tǒng)功效是活血調(diào)經(jīng)，疏肝解郁，主要用于治療氣滯血瘀、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、閉經(jīng)、胸肋脹痛[2]。月季果實(shí)未被充分利用而被丟棄，造成資源的浪費(fèi)。現(xiàn)代研究表明，月季中主含黃酮類、酚酸類、芳香油類和色素類等[3-9]。其中黃酮類成分在抗氧化[6-8]、抗真菌[9-10]、抗腫瘤[11]、抗衰老[12]等方面具有良好的生物活性，具有廣泛的開發(fā)前景。對于月季花、葉、果實(shí)總黃酮含量測定方法已有報(bào)道，但涉及月季花、葉、果總黃酮含量的比較還未見報(bào)道，本次試驗(yàn)旨在探討月季不同部位總黃酮的含量，并采用DPPH法評價(jià)月季葉中總黃酮抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)植物資源提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HA2004電子分析天平：上海象平儀器儀表有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；101-8型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱：江蘇金壇市佳美儀器有限公司。

1.2 材料

樣地設(shè)在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，于2017年9月，在樣地中選取5株生長正常的月季植株，分別剪下葉、花、果實(shí)，用濕布包裹，塑料袋封裝，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。將材料洗凈，用濾紙吸干，其中，果實(shí)去除種子，于80℃烘干，粉碎，過篩，將烘干樣品放入廣口瓶，置于-20℃冰箱保存，備用。蘆丁對照品：購自中國食品藥品檢定研究院（批號：100080-201408）；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：購自東京化成工業(yè)株式會社（CAS：1898-66-4）；95%乙醇、NaNO2等試劑均為分析純，購于天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 月季花、葉、果實(shí)中總黃酮含量的測定

2.1.1 蘆丁對照品溶液的制備

取蘆丁對照品25.0 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加乙醇少量使其溶解，然后用乙醇定容至刻度。從母液中精密量取10.00mL，置于50mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻即得蘆丁對照品溶液（0.1 mg/mL）。

2.1.2 供試品溶液的制備

取葉、花、果實(shí)粗粉約1 g，各取3份，精密稱定，倒入250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL 95%乙醇，分別加熱（60℃）回流提取3次，過濾，合并濾液，于50℃減壓濃縮至干，加水50 mL懸浮，加石油醚洗滌3次，棄去石油醚部分，水相再加乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部分，減壓濃縮至無乙酸乙酯味，加少量乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，即得供試品溶液，備用。

2.1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁對照品溶液 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入0.4 mL 5%硝酸鈉，搖勻后放置6 min，加入0.4 mL 10%硝酸鋁，放置6 min，再加入4 mL 4%NaOH溶液，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，用紫外-可見分光光度計(jì)上測定不同濃度蘆丁對照品溶液在510 nm處的吸光度A510。以蘆丁濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

精密量取6份對照品溶液2 mL，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法，在510 nm波長處分別測定吸光度A，計(jì)算RSD值。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.1.2”項(xiàng)下月季葉的供試品溶液和“2.1.1”項(xiàng)下的蘆丁對照品溶液各1 mL，于室溫條件下放置 0、2、4、6、8、10 h，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法，分別測定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度A，計(jì)算RSD值。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密吸取6份“2.1.2”項(xiàng)下月季葉的供試品溶液1 mL，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法，測定吸光度A，計(jì)算RSD值。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn)

分別取“2.1.2”項(xiàng)下已知總黃酮含量（21.73 mg/g）的月季葉供試品溶液6份，約10.87 mg，精密稱定，按1∶1（質(zhì)量比）比例加入對照品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法，測定吸光度A，計(jì)算回收率和RSD值。

2.1.8 供試品中總黃酮含量測定

精密吸取月季花、果實(shí)、葉片供試品溶液3.00、3.00、1.00 mL，置于 10 mL 容量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測吸光度。代入回歸方程得試驗(yàn)結(jié)果。

2.2 月季總黃酮抗氧化活性測定

2.2.1 供試品溶液制備

以“2.1.2”項(xiàng)下方法制備月季葉的樣品液作為母液，從母液量取適量溶液置25 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，分別制成質(zhì)量濃度為4、8、12、16、20、24、32、36、40 μg/mL（以總黃酮含量計(jì)）的供試品溶液，備用。

2.2.2 DPPH樣品溶液配制

精確稱取13.0 mg的DPPH（分子量：394）到50 mL的容量瓶中，無水乙醇定容，配制成6.5×10-4mol/L的儲備溶液，取出10 mL的儲備液，置于50 mL容量瓶中，無水乙醇溶液稀釋至刻度，制得濃度為1.3×10－5mol/L的DPPH溶液，備用。

2.2.3 維生素C樣品溶液的配制

維生素 C（分子量：176）10.0 mg，精確稱定，置于100 mL的容量瓶中，用少量無水乙醇溶解，然后用無水乙醇稀釋至刻度，配制成維生素C濃度為0.57 mmol/L的儲備液。分別取出 1、2、3、4、5、6、8、9、10 mL 的維生素C儲備液分別于25 mL的容量瓶中，用無水乙醇定容，配制成 4、8、12、16、20、24、32、36、40 μg/mL 維生素C的一系列溶液。

2.2.4 月季葉中總黃酮對DPPH自由基清除活性的測定

在10 mL試管中分別加入2 mL的1.3×10－5mol/L DPPH溶液和2 mL的不同濃度的各樣品溶液，密封，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定各樣品溶液的吸光度為A1，同時(shí)以等量乙醇溶液作為空白對照，并且平行測定用乙醇溶液作參比時(shí)的吸光度A2（即為2 mL的1.3×10－5mol/L DPPH溶液加入2 mL的無水乙醇溶液），測定2 mL的無水乙醇溶液和2 mL不同濃度的各樣品液混合液的吸光度為A0。根據(jù)下面的公式計(jì)算清除率及EC50。

式中：A2為2 mLDPPH中加入2 mL的無水乙醇的吸光度；A1為2 mLDPPH中加入2 mL各樣品溶液的吸光度；A0為2 mL無水乙醇中加入2 mL各樣品液的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，為A510為縱坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程為：y=0.013x+0.017，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。在 4.94 μg/mL～49.40 μg/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The figure of standard curve

3.2 精密度試驗(yàn)

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1，計(jì)算RSD為0.38%（n=6），表明該試驗(yàn)精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)（n=6）Table 1 The results of precision test（n=6）

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

月季葉供試品溶液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表2，計(jì)算RSD為0.50%和0.51%（n=6），表明樣品和蘆丁對照品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 The results of stability test（n=6）

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

月季葉供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表3，計(jì)算RSD為0.27%（n=6），表明該試驗(yàn)重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 The results of repeatability test（n=6）

3.5 加樣回收率試驗(yàn)

月季葉的供試品溶液加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4，計(jì)算平均加樣回收率為99.09%，RSD為0.53%（n=6），表明該試驗(yàn)加樣回收率良好。

3.6 月季不同部位總黃酮含量測定

月季花、果、葉中總黃酮含量分別（12.01±0.09）mg/g，（n=6）、（5.16±0.12）mg/g （n=6）、（21.73±0.16）mg/g，（n=6）。月季葉中總黃酮含量明顯高于花和果?？傸S酮含量測定結(jié)果見表5。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 4 The results of recovery test（n=6）

表5 月季不同部位總黃酮的含量測定結(jié)果Table 5 Content distribution of total flavonoids in different parts of Rosa chinensis Jacq.

3.7 DPPH自由基清除作用的測定

不同濃度的月季葉的總黃酮溶液、對照品VC溶液對DPPH自由基清除率結(jié)果見圖2。

圖2 月季葉的總黃酮和VC對DPPH自由基的清除作用Fig.2 The scavenging effect of flavonoids and ascorbic acid on DPPH radical

在濃度 1 μg/mL～24 μg/mL 范圍內(nèi)其清除能力隨總黃酮濃度的升高而加強(qiáng)，而濃度增加為36 μg/mL，清除率增加不明顯，并趨于平衡。根據(jù)SPSS22.0軟件數(shù)據(jù)分析，得到月季總黃酮EC50為1.023 μg/mL和VC的EC50為11.297 μg/mL，可見，月季總黃酮對DPPH清除率明顯高于VC。

4 討論與結(jié)論

1）目前尚未見到比較月季花、葉和果實(shí)的總黃酮含量的的相關(guān)報(bào)道，因此，本試驗(yàn)以蘆丁為對照品，硝酸鈉、硝酸鋁及氫氧化鈉為顯色劑，采用紫外分光光度法測定月季不同部位總黃酮的含量。通過方法學(xué)考察，結(jié)果表明，該方法用于測定月季花、葉、果實(shí)總黃酮含量，精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均符合含量測定要求，操作簡便，結(jié)果可靠，為今后月季總黃酮含量的檢測提供便捷的方法。

2）月季資源豐富，全國各地都有栽培，月季花利用率較高，但是其葉、果利用率很低，造成資源的浪費(fèi)。本次試驗(yàn)通過測定月季不同部位總黃酮含量可知，葉中總黃酮含量最高，其次是花和果實(shí)；葉中總黃酮含量為21.73 mg/g，且月季葉中總黃酮對于DPPH的清除能力明顯高于VC，可以開發(fā)成天然抗氧化劑，具有潛在的研究和開發(fā)價(jià)值。