趙雅晨李 季 胡炯圣 劉 璐 王萌萌蘇 志 錢 勇＊, Peter J.Sadler 劉紅科＊,

(1南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，南京 210023)

(2Department of Chemistry，University ofWarwick，Coventry CV4 7AL，UK)

癌癥作為導(dǎo)致人類疾病死亡的原因之一，嚴重威脅著人類的生命健康。治療癌癥的化療藥物主要有順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等鉑類藥物，然而在后期的使用過程中，這類藥物暴露出高毒性、耐藥性等問題[1-4]。因此，研究新型的抗癌藥物迫在眉睫，對于治療癌癥具有重要意義[5-6]。芳基金屬配合物由于其較低的細胞毒性、成鍵模式的多樣性等特點引起了很大的關(guān)注，被認為是最有前景的金屬抗癌藥物之一[7-9]。鋨與釕性質(zhì)相似，金屬鋨類配合物也可作為潛在的抗癌藥物[10-11]。DNA是具有生物遺傳功能的分子，影響著細胞的轉(zhuǎn)錄與翻譯，是許多抗癌藥物作用的靶點[12-14]。

我們課題組最近報道了一種合成方法，用來合成含咪唑嗡離子的單核芳基釕配合物RuL2CH2[15]?；谶@種合成方法，本文利用1，4-二(1-咪唑基-亞甲基)-2，3，5，6-四甲基苯(p-bitmb)與[(η6-cymene)Os(μ-Cl)Cl]2或[(bip)Os(μ-Cl)Cl]2反應(yīng)，合成了 2 種單核芳基鋨配合物。通過核磁共振氫譜研究了配合物中亞甲基的來源。用紫外光譜和圓二色譜(CD)研究了配合物與DNA的作用方式及配合物在緩沖溶液中的穩(wěn)定性，同時還研究了配合物對不同陰離子的響應(yīng)。

Scheme 1 Synthesis ofmononuclear Osギ-arenemetallamacrocyclic complexes 1 and 2 withmethylene bridge by a solvothermal reaction

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

CT-DNA和氘代試劑購自Sigma Aldrich，磷酸緩沖溶液(PBS)等均購自上海生物工程股份有限公司。實驗所用溶劑均來自于國藥集團，分析純，未進行進一步純化。晶體結(jié)構(gòu)用Bruker Smart ApexⅡCCD衍射儀進行測試，1H NMR用Bruck AVANCE 400 MHz/Bruck AVANCE 600MHz核磁共振波譜儀測定，C、H、N元素分析使用元素分析儀 (vario ELⅢ，賀力氏公司，德國)測定。圓二色譜(CD光譜)通過英國Applied Photophysics公司生產(chǎn)的Chriascan儀器測定。采用Thermo LCQFLEET電噴霧質(zhì)譜儀測定配合物的m/z(Source voltage 4.0 kV，流動相為甲醇/乙腈，流速為 200 pL·min-1，直接進樣)，紫外吸收分光光譜儀為Varian Cary 50分光光度計。

1.2 配合物的合成

1.2.1 配合物[(p-cymene)Os(L)Cl]Cl3·CH2Cl2(1)(L=(p-bitmb)2CH2)

將 [(p-cymene)OsCl(μ-Cl)]2(0.012 5 mmol，9.8 mg)，1，4-二(1-咪唑基-亞甲基)-2,3,5，6-四甲基苯(pbitmb)(0.075 mmol，23.52 mg)加入 2.5 mL 的二氯甲烷溶液，超聲2～5min，放入裝有聚四氟乙烯的內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，放入80℃的烘箱，反應(yīng)48 h后冷卻至室溫，得到淡黃色晶體。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ10.13(s，2H)，8.48(s，2H)，8.24(d，J=1.8 Hz，2H)，7.95(s,2H)，7.62～7.29(m，4H)，6.37(d，J=14.1 Hz，1H)，6.20(d，J=14.1 Hz，1H)，5.93(d，J=5.4 Hz，2H)，5.76～5.67(m，2H)，5.56(d，J=15.1 Hz，2H)，5.49～5.39(m，4H)，5.34(s，1H)，5.31(d，J=2.4 Hz，1H)，2.66(s，1H)，2.19(s，24H)，1.38(s，3H)，0.91(d，J=6.9 Hz，6H)。 ESIMS[(p-cymene)Os(L)Cl]3+m/z：理論值 320.91，實測值321.33。元素分析按分子式OsC47H60N8Cl4·CH2Cl2計算，理論值(%)：C 49.96,H 5.41,N 9.71;實測值(%)：C 50.02；H 6.10；N 9.82。

1.2.2 配合物[(bip)Os(L)Cl]Cl3·2CH2Cl2·H2O(2)(L=(p-bitmb)2CH2)

配合物2的合成與1類似，將[(p-cymene)OsCl(μ-Cl)]2換成 [(bip)OsCl(μ-Cl)]2(0.012 5 mmol，10.4 mg)，烘箱溫度為100℃，其余條件不變。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ10.17(s,2H),8.35(d，J=1.4 Hz，4H),7.97(s，2H)，7.41～7.22(m，8H)，6.49(d，J=14.1 Hz，1H),6.40(d，J=14.1 Hz，1H)，6.29～6.20(m，4H)，5.74(t，J=5.0 Hz,1H),5.56(d,J=15.0 Hz,3H),5.39(dd，J=31.8,15.0 Hz,4H),5.21(d,J=15.0 Hz，2H)，2.19(s，24H)。 ESI-MS [(bip)Os(L)Cl]3+m/z：理論值 327.57，實測值327.92；{[(bip)Os(L)Cl]Cl}2+m/z：理論值 509.09，實測值 509.25；{[(bip)Os(L)Cl]Cl2}+m/z：理論值 1 053.63，實測值1 053.25。元素分析按分子式OsC49H56N8Cl4·2CH2Cl2·H2O 計算,理論值(%):C 47.97,H 4.89,N 8.78;實測值(%)：C 47.76，H 5.02，N 9.04。

1.3 X射線單晶結(jié)構(gòu)測定

選取大小為0.1mm×0.05mm×0.05mm配合物1的晶體置于單晶衍射儀上，以經(jīng)石墨單色器單色化的 Mo Kα 射線(λ=0.071 073 nm)做入射光源，以ω-2θ掃描方式在296 K下收集衍射點。采用SAINT和SADABS程序進行吸收校正，晶體結(jié)構(gòu)經(jīng)過直接法解出。所有非H原子都經(jīng)過各向異性處理，晶體結(jié)構(gòu)通過使用OLEX2 1.2-beta內(nèi)的SHELXT[16]程序在F2上通過全矩陣最小二乘法進行精修，由于有無序溶劑分子的存在，故采用squeeze對其進行進一步的精修。晶體數(shù)據(jù)列于表1。

CCDC：1841765，1。

表1 配合物1的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Crystallographic data for 1

1.4 配合物的穩(wěn)定性研究

通過紫外光譜測定配合物1和2在緩沖溶液中的穩(wěn)定性(10 h)[14]。配制濃度為 200 μmol·L-1的配合物 1 和 2 溶液(VDMSO∶VPBS=5∶95)，用路徑為 1 cm 的石英比色皿，設(shè)置波長間隔為1 nm，波長范圍為200～600 nm，在室溫下每隔1 h記錄1次數(shù)據(jù)。

1.5 紫外滴定實驗-研究配合物與CT-DNA的相互作用

配制2mmol·L-1配合物1和2的DMSO溶液，分別用 PBS 稀釋到濃度為 200 μmol·L-1(VDMSO∶VPBS=5∶95)。紫外滴定過程中保持配合物的濃度不變，用雙通道進行測試(比色皿的體積為1 mL，厚度為1 cm)，即以PBS或者相應(yīng)濃度的DNA作為空白參照，加入等份的 CT-DNA(3.64 mmol·L-1)改變 DNA的濃度 (每次加1μL)混合均勻后靜置10min，在200～500 nm的波長范圍內(nèi)記錄吸光度值。

1.6 圓二色譜研究配合物對DNA結(jié)構(gòu)的影響

配制濃度為 100μmol·L-1的 CT-DNA，固定DNA的濃度，配制不同比例的配合物溶液使ccomlex/cDNA的比例 r依次為 0、0.1、0.2、0.3、0.4，即配合物的濃度依次為 0、10、20、30、40 μmol·L-1，在 37 ℃下孵化24 h后進行測試。

1.7 核磁共振研究亞甲基的來源

為了研究單晶結(jié)構(gòu)中亞甲基是否來源于溶劑二氯甲烷，我們將溶劑換成氘代二氯甲烷在相同條件下進行溶劑熱反應(yīng),即以[(p-cymene)OsCl(μ-Cl)]2(0.012 5 mmol，9.8 mg)，1，4-二 (1-咪唑基-亞甲基)-2,3，5，6-四甲基苯(p-bitmb)(0.075mmol，23.52mg)為原料，加入2.5 mL的氘代二氯甲烷溶液，超聲2～5 min，放入裝有聚四氟乙烯的內(nèi)襯的反應(yīng)釜，在80℃的烘箱中反應(yīng)48 h。待冷卻到室溫以后，收集晶體，洗滌，真空干燥后在DMSO-d6中進行核磁共振研究。

1.8 粘度法測試配合物與CT-DNA的相互作用

粘度用烏氏粘度計進行測量，保持溫度(25±0.1)℃。測試液配制方法：固定DNA的濃度，逐漸增加配合物濃度的方法配制。測試溶液的相對粘度用下列公式計算[17]：

其中t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細管所需時間，t為DNA溶液或者含不同濃度配合物的DNA溶液流經(jīng)毛細管所需要的時間。 以(η/η0)1/3對比率 r(cEB/cDNA或ccomlex/cDNA)作圖，η0為未加配合物時DNA的相對粘度。

1.9 配合物的細胞毒性測試

實驗選取了3種細胞株：人卵巢癌細胞(A2780)，肺癌細胞(A549)和正常肝臟細胞(L02)。細胞在含10%的血清培養(yǎng)基RPMI1640(Gibco BRL)中37℃培養(yǎng)。具體實驗方法：將細胞以5 000個每孔的初始密度接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，并在培養(yǎng)基中進行培育24 h。加入100μL陰性和陽性對照以及不同濃度的配合物 (VDMSO∶V培養(yǎng)基=1∶99)， 在 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別向孔中加入20μL 5 mg·mL-1的MTT溶液，然后孵化4 h，移除96孔板中的培養(yǎng)基，加入150μL的DMSO，利用酶標(biāo)儀(Infinite M200，Tecan，Mnnedorf，Switzerland) 在 590 nm的掃描波長下測試其吸光度值，用SPSSinc軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算得到配合物的IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)

配合物1的晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示，主要鍵長和鍵角見表2。配合物1為一個單核鋨的結(jié)構(gòu)。中心鋨原子與2個p-bitmb配體上的氮原子以及氯原子進行配位，形成了一個以芳基鋨為中心的配位端；pbitmb配體中另一端的咪唑環(huán)通過一個亞甲基進行連接，形成了咪唑嗡離子的有機端。最終，配合物1形成一個類似“碗”狀的單核金屬環(huán)狀結(jié)構(gòu)。配合物1屬于單斜晶系，P21/c空間群。配合物1的空腔內(nèi)有一個氯離子(Cl2)與配體上的 C11、C28、C32、C47以及芳環(huán)中C2上的相應(yīng)氫原子形成氫鍵(表3)。配合物1的“碗狀”分子在空間上為兩種取向，形成了如圖1(c)所示的二維堆積。

圖1 (a)裝載有氯離子的類似“碗狀”的單核金屬環(huán)OsLCl(L=(p-bitmb)2CH2)配合物的單晶結(jié)構(gòu),(b)具有“碗狀”結(jié)構(gòu)的配合物1側(cè)面圖,(c)配合物1的二維堆積圖Fig.1 (a)X-ray crystal structure of the “bowl-like” mononuclear OsLCl(L=(p-bitmb)2CH2)metallamacrocycle 1 with a Cl-anion trapped inside the cavity;(b)Side view to show the trapped chloride anion inside the “bowl-like” structure of complex 1;(c)Packingmode of complex 1

表2 配合物1的部分鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)for 1

表3 配合物1的氫鍵數(shù)據(jù)Table 3 Hydrogen bond geometry of comp lex 1

2.2 核磁共振氫譜驗證亞甲基的來源

為了驗證單核金屬環(huán)OsLCl(L=(p-bitmb)2CH2)中橋連亞甲基的來源。我們用氘代二氯甲烷代替二氯甲烷，在相同條件下進行溶劑熱反應(yīng)，即在80℃的烘箱中反應(yīng)48 h。待冷卻到室溫以后，收集晶體，洗滌，干燥樣品后進行核磁檢測。結(jié)果如圖2所示，圖2(a)是以CD2Cl2為溶劑所得配合物的1H NMR，圖2(b)為以CH2Cl2為溶劑所得配合物1的1H NMR。以CH2Cl2為溶劑所得晶體的核磁結(jié)果顯示在δ6.449～6.223出現(xiàn)了2個分裂的峰(-CH2-)，這可能是由于合成的單核環(huán)狀配合物1結(jié)構(gòu)的不對稱性所導(dǎo)致的[18]。當(dāng)溶劑為氘代二氯甲烷時，在δ6.449～6.223處的峰消失。結(jié)果表明亞甲基來自于溶劑二氯甲烷。

圖2 以CD2Cl2(a)或CH2Cl2(b)為溶劑通過溶劑熱反應(yīng)得到配合物1的1H NMR譜Fig.2 1H NMR spectra of 1 in DMSO-d6 solution obtained from the solvothermal reaction in CD2Cl2(a)or CH2Cl2(b)

2.3 配合物的穩(wěn)定性研究

通過紫外光譜研究了配合物在DMSO/PBS溶液(VDMSO/VPBS=5∶95)中的穩(wěn)定性(圖 3)，配合物 1 的吸收峰出現(xiàn)在237和279 nm處，分別歸屬于配合物中金屬到配體的電荷躍遷(MLCT)以及配體內(nèi)部的電荷躍遷(IL)[19]。水解反應(yīng)10 h以后，配合物1的紫外吸收峰強度幾乎未發(fā)生變化。配合物2的吸收峰出現(xiàn)在235和287 nm處，分別歸屬于配合物的MLCT和IL躍遷。在10 h內(nèi)，配合物的最大吸峰強度幾位置未發(fā)生明顯變化。由上可知，配合物1和2在DMSO/PBS溶液中可以穩(wěn)定存在。

2.4 紫外滴定實驗研究配合物與CT-DNA的相互作用

DNA是金屬抗癌藥的作用靶點之一，在配合物中加入DNA后會引起其紫外吸收強度的變化，使配合物出現(xiàn)增色或者減色現(xiàn)象[20-22]。從圖4可以看出，在200μmol·L-1的配合物中逐漸加入CT-DNA，配合物1和2的吸光度值都呈現(xiàn)增色效應(yīng)。

為了進一步比較配合物與DNA作用的情況，在紫外滴定實驗的基礎(chǔ)上通過Benesi-Hildebrand方程式計算配合物DNA的結(jié)合常數(shù)[23]：

圖3 配合物1和2在DMSO/PBS溶液中的紫外吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of complexes 1(a)and 2(b)in DMSO/PBSsolution

圖4 配合物1(a)和2(b)隨CT-DNA濃度增加的紫外吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of the complexes 1(a)and 2(b)in the absence and presence of increasing concentrations of CT-DNA

其中εa、εb、εf分別為配合物的表觀吸收系數(shù)，配合物完全結(jié)合DNA的吸收系數(shù)和純配合物的吸收系數(shù)。根據(jù)方程式線性擬合，通過斜率和截距來計算配合物的結(jié)合常數(shù)Kb。

根據(jù)Benesi-Hildebrand方程計算得到配合物1和2與CT-DNA的結(jié)合常數(shù)，分別為3.22×104L·mol-1，1.53×104L·mol-1。配合物 1 與 CT-DNA 結(jié)合能力大于2的，與已經(jīng)報道的單核吡啶芳基鋨配合物與DNA作用的結(jié)合常數(shù)大致在同一數(shù)量級[24]。

2.5 圓二色譜研究配合物對DNA結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜常用來研究配合物與DNA的相互作用，一般B型DNA較為常見，其正吸收峰出現(xiàn)在275 nm附近，與DNA的堿基堆積有關(guān)；負峰出現(xiàn)在245 nm附近，與DNA的右手螺旋性質(zhì)有關(guān)[25]。圖5為配合物1和2與CT-DNA相互作用的圓二色譜圖。配合物1和2的變化趨勢相似，即隨著配合物濃度的增大，DNA在275 nm處的正峰信號減弱，說明加入配合物影響了CT-DNA的堿基堆積作用，并且CT-DNA的負峰強度(245 nm附近的峰強度)隨著配合物濃度的增大而下降。對配合物1而言，當(dāng)r=0.2時，CT-DNA信號峰值接近與0，說明1對DNA的堿基堆積和右手螺旋性質(zhì)產(chǎn)生較大的影響。對于配合物2而言，當(dāng)r=0.4時，CT-DNA的負峰接近于0，說明配合物2也影響了DNA的右手螺旋性質(zhì)。上述結(jié)果表明，配合物均可以與DNA發(fā)生相互作用，減弱DNA的堿基堆積作用并對DNA的右手螺旋性質(zhì)產(chǎn)生影響。

2.6 粘度法測試配合物與CT-DNA的相互作用

圖5 配合物1(a)、2(b)與CT-DNA相互作用的圓二色譜圖Fig.5 CD spectra of CT-DNA in the absence and presence of complexes 1(a)or 2(b)

粘度測試是研究配合物與DNA作用方式的方法之一。配合物與CT-DNA以嵌入方式相互作用時，DNA雙螺旋鏈增長，DNA粘度增大；以部分插入的方式作用時，DNA溶液的粘度降低；以靜電或溝面方式作用時，DNA溶液的粘度未發(fā)生明顯變化[26]。溴化乙錠(EB)是典型的DNA嵌入劑，與DNA發(fā)生作用時會使其粘度增加。由圖6可知，隨配合物1、2濃度的增加，DNA的粘度呈增加的趨勢，類似于EB，結(jié)果表明配合物以嵌入的方式與DNA結(jié)合。

圖 6 EB(■)、配合物1(●)和 2(▲)濃度的增加對 DNA粘度的影響Fig.6 Effecton the relative viscosity of CT-DNA after addition of increasing amounts of ethidium bromide(■),1(●)and 2(▲)in PBS

2.7 配合物的細胞毒性

采用MTT法研究了配合物對人卵巢癌細胞(A2780)、肺癌細胞(A549)以及正常的肝臟細胞(L02)的細胞毒性。配合物的IC50結(jié)果表明，配合物1和2對癌細胞A2780、A549和正常細胞L02基本沒有毒性，其毒性遠遠低于順鉑。

表4 配合物1和2的IC50Table 4 IC50 of com plexes 1 and 2 μmol·L-1

3 結(jié) 論

合成、表征了2種“碗狀”單核芳基金屬鋨配合物。配合物的單晶結(jié)構(gòu)表明芳基鋨的Osギ與2個配體的咪唑氮原子以及氯原子配位，2個配體的另一個咪唑基團通過一個亞甲基碳原子連接形成咪唑嗡離子。在氘代試劑中合成配合物并通過核磁共振方法證實橋聯(lián)亞甲基基團來自于溶劑二氯甲烷。配合物在緩沖溶液中可以穩(wěn)定存在，并以嵌入的方式與DNA相互作用，影響DNA的螺旋性質(zhì)及堿基堆積作用。本研究為合成同時具有配位端及咪唑嗡離子端的配合物提供了一個方法。