曹尚杰，焦孟月，張彥妮，岳莉然

矮牽牛(Petunia hybrida)屬茄科多年生草本植物，在東北地區(qū)常作一二年生栽培。因其花色豐富、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)被長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用于世界各地園林，并被譽(yù)為花壇之王;又因其生命周期短、遺傳背景清晰、易于進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因?qū)氲葍?yōu)點(diǎn)在開(kāi)花分子生物學(xué)研究上成為模式植物［1］，并為植物基因工程中驗(yàn)證基因功能［2-3］及創(chuàng)造新品種提供了有利條件［4］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究較為深入，但矮牽牛再生方式受基因型限制，現(xiàn)有的遺傳轉(zhuǎn)化體系通用性不強(qiáng)，不同學(xué)者得出的結(jié)論也不盡相同［5-7］，因此，要在前人的基礎(chǔ)上針對(duì)不同品種進(jìn)行試驗(yàn)摸索其適宜的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

IPT基因在一些植物中表達(dá)，均表現(xiàn)出葉片內(nèi)源細(xì)胞分裂素(Cytokinins，CTK)含量增加，植株衰老延緩［8］。早期研究大多使用組成型表達(dá)啟動(dòng)子(如CaMV35S)驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)，但CTK過(guò)量表達(dá)影響植株正常生長(zhǎng)發(fā)育，如抑制莖的伸長(zhǎng)及側(cè)根形成、喪失頂端優(yōu)勢(shì)、植株矮小等［9］。因此IPT基因的轉(zhuǎn)化研究中，對(duì)啟動(dòng)子的選擇尤為重要。許多研究已證明，SARK啟動(dòng)子調(diào)控IPT基因可以在干旱條件下表達(dá)，保證較高的CTK含量，增強(qiáng)光合速率，降低作物產(chǎn)量的損失。已有研究獲得的轉(zhuǎn)PSARK-IPT基因的水稻、花生、棉花、玉米等作物，在干旱脅迫條件下均表現(xiàn)出降低產(chǎn)量損失的優(yōu)勢(shì)，且未改變谷物的主要成分［10-12］。矮牽?！妨帧?yàn)殚_(kāi)花早、花色多樣而在城市園林綠化中應(yīng)用廣泛，但其抗旱性較差，因此可以對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)改良，來(lái)提高其抗性，延長(zhǎng)其觀賞期。目前有關(guān)該品種的遺傳轉(zhuǎn)化研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究以矮牽牛‘梅林’為材料，旨在建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系，導(dǎo)入IPT基因，期望獲得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)一步從中選育出花期延長(zhǎng)、花量增加或抗性提高的矮牽牛新品種，為今后利用轉(zhuǎn)基因方法改良矮牽牛品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

‘梅林’(‘Merlin’)矮牽牛無(wú)菌苗(培養(yǎng)于東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室)。攜帶有PSARK-IPT基因的農(nóng)桿菌菌株P(guān)SICHyg-2(由加州大學(xué)戴維斯分校的Blumwald Eduardo教授惠贈(zèng))保存于東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 抗生素敏感性試驗(yàn) 在葉片分化培養(yǎng)基(MS+3.0 mg·L－16-BA+0.1 mg·L－1NAA)和生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.1 mg·L－1IBA)中添加不同濃度的潮霉素(Hey)(0、1、2、3、4、5 mg·L－1)，分別接種預(yù)培養(yǎng)2 d的葉盤(pán)和生長(zhǎng)健壯的不定芽，光照培養(yǎng)15 d，每種處理30個(gè)外植體，3次重復(fù)，觀察統(tǒng)計(jì)愈傷及芽的分化情況和不定芽的生長(zhǎng)及生根狀況，確定合適的抗生素使用濃度。

1.2.2 農(nóng)桿菌葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化 選取生長(zhǎng)健壯的矮牽牛幼苗，將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的葉盤(pán)，接種于葉片分化培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)即可用于轉(zhuǎn)化。

1.2.2.1 外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的確定 轉(zhuǎn)化前，將剪好的矮牽牛葉盤(pán)分別置于葉片分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1、2、3、4 d 再用于侵染［用稀釋好的菌液(OD600=0.5)侵染3 min］，將侵染過(guò)的葉片接種于葉片分化培養(yǎng)基上，于28℃黑暗條件下共培養(yǎng)36 h，之后轉(zhuǎn)移到添加有500 mg·L－1的頭孢霉素(Cef)和2 mg·L－1的潮霉素的葉片分化培養(yǎng)基。每15 d繼代1次，直至長(zhǎng)出抗性愈傷組織或抗性芽。統(tǒng)計(jì)其抗性愈傷分化率和抗性芽分化率。

1.2.2.2 菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間的確定

在超凈工作臺(tái)上，用稀釋好OD600值分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、0.9 的菌液侵染預(yù)培養(yǎng)(預(yù)培養(yǎng)時(shí)間選取上面得到的結(jié)果)過(guò)的矮牽牛葉片，侵染時(shí)間分別設(shè)置為1、3、5 min和8 min，之后將葉片接種到葉片分化培養(yǎng)基上，置于28℃黑暗條件下完成共培養(yǎng) 24、36、48、60 h，繼而接種于篩選培養(yǎng)基(MS+3.0 mg·L－16-BA+0.1 mg·L－1NAA+2 mg·L－1Hyg)上培育，每15 d繼代1次，直至長(zhǎng)出抗性愈傷組織或抗性芽。統(tǒng)計(jì)其抗性愈傷分化率和抗性芽分化率。

1.2.2.3 脫菌頭孢濃度的確定 在分化培養(yǎng)基上添加不同濃度的 Cef:0、100、200、300、400、500 mg·L－1。將完成侵染后的外植體接種于上述培養(yǎng)基上，每2 d觀察外植體的染菌及生長(zhǎng)狀況，15 d后統(tǒng)計(jì)外植體的染菌率及分化率，確定最適的脫菌濃度。

試驗(yàn)除了處理?xiàng)l件的變化，其他培養(yǎng)條件均相同，每個(gè)處理均設(shè)置30個(gè)外植體，重復(fù)3次。之后將具有潮霉素抗性的不定芽接種在添加有4 mg·L－1的潮霉素的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選和生根培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)置2組對(duì)照，一組為未轉(zhuǎn)化株系于分化及生根篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，另一組為未轉(zhuǎn)化株系接種于不添加Hey的分化及生根培養(yǎng)基。

所有MS基本培養(yǎng)基均含含2.5%蔗糖和0.76%瓊脂，pH 值 5.8～6.0。培養(yǎng)條件:光照時(shí)間 16 h·d－1，光照強(qiáng)度(90±10)μmol·m－2·s－1，溫度 24℃，濕度40%。

1.2.3 抗性植株的分子檢測(cè) 基因組DNA提取及PCR檢測(cè):取抗性植株葉片，用基因組DNA提取試劑盒(天根技術(shù)有限公司)提取DNA，以此DNA為模板，未轉(zhuǎn)化植株DNA為陰性對(duì)照，無(wú)菌水為空白對(duì)照，PBI101-IPT質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，SARK-1F:5'-GAAGGAATGCTCGTTGTCTC-3'為上游引物，SARK-1R:5'-GCTTGGCTGCGATGATAC-3'為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為:1μL模板，1 μL上游引物，1 μL 下游引物，12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，9.5 μL ddH2O。擴(kuò)增條件為:94℃ 預(yù)變性 5 min;94℃變性30 s;56℃退火30 s;72℃延伸90 s;72℃延伸10 min;10℃終止;4℃保存，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析，電壓120V，15 min。

RNA提取及 RT-PCR檢測(cè):為進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系，以Trizol為提取試劑，提取抗性植株葉片總RNA，以此RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)率成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR，PCR體系及條件同上。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用Excel及SPSS19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理分析。

染菌率=(染菌外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%

抗性愈傷分化率=(分化抗性愈傷外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%

抗性芽分化率=(分化抗性芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 潮霉素對(duì)矮牽牛葉片和不定芽篩選壓的確定

隨著Hey濃度升高，愈傷組織誘導(dǎo)率、不定芽生根率及生根系數(shù)逐漸降低(表1)，當(dāng)潮霉素濃度＞2 mg·L－1時(shí)，愈傷體積變小，且黃化，長(zhǎng)勢(shì)逐漸變差，出芽能力喪失(圖1)。生根過(guò)程中，隨著潮霉素濃度的升高，生根率及生根系數(shù)逐漸降低，濃度為5 mg·L－1時(shí)，生根率為0(表2)。Hey的濃度也會(huì)影響外植體的形態(tài)，隨著濃度的升高，外植體須根數(shù)量減少，根系變短，植株縱向生長(zhǎng)受到抑制，當(dāng)Hey濃度為3 mg·L－1外植體葉片開(kāi)始出現(xiàn)黃化現(xiàn)象(圖2)，潮霉素濃度為4 mg·L－1時(shí)，外植體基本失去生根能力。綜合考慮，把2 mg·L－1潮霉素作為矮牽牛葉片的篩選濃度，4 mg·L－1潮霉素作為矮牽牛不定芽的生根篩選濃度。

表1 不同濃度潮霉素對(duì)矮牽牛分化率的影響Table 1 Effects of different concentrations of Hey on leaf differentiation

圖1 不同濃度潮霉素對(duì)葉片分化的影響Fig.1 Effects of different concentrations of hygromycin on leaf differentiation

表2 不同濃度潮霉素對(duì)矮牽牛生根的影響Table 2 Effects of different concentrations of Hey on rooting

2.2 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性愈傷形成率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(表3)，預(yù)培養(yǎng)2 d的抗性愈傷及芽的分化率最高，分別為61.28%和1.60%，預(yù)培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)化率降為0，因此2 d為最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間。

2.3 菌液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

隨著菌液濃度的升高，抗性愈傷及抗性芽分化率均先升高后降低(表4)，OD600=0.5時(shí)，愈傷及芽的分化率達(dá)到最大值，所以侵染矮牽?！妨帧贩N葉片外植體的最適農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.5。

2.4 侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

侵染時(shí)間延長(zhǎng)，抗性愈傷及芽的分化率先升高后降低，侵染3 min抗性愈傷及芽分化率最大(表5)，因此3 min是矮牽牛轉(zhuǎn)化的最佳侵染時(shí)間。

圖2 不同濃度潮霉素下矮牽牛生根狀況Fig.2 Status of different concentrations of Hey on rooting

表3 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)矮牽牛轉(zhuǎn)化效率的影響Table 3 Frequency of the transformation of Petunia with different pre-culture time %

表4 OD600值對(duì)矮牽牛轉(zhuǎn)化效率的影響Table 4 Frequency of the transformation of Petunia with different values of OD600 %

表5 侵染時(shí)間對(duì)矮牽牛轉(zhuǎn)化效率的影響Table 5 Frequency of the transformation of Petunia with different infection time

2.5 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

隨共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性愈傷及芽分化率先升高后降低。共培養(yǎng)24 h，抗性愈傷分化率低且無(wú)抗性芽產(chǎn)生(表6)。共培養(yǎng)時(shí)間在48 h及以上時(shí)，葉片邊緣變褐，葉緣分布少量菌液，后期農(nóng)桿菌不易控制，且抗性愈傷及芽分化率低。共培養(yǎng)36 h，葉片無(wú)明顯變化，此時(shí)抗性愈傷及芽分化率最高，因此選擇36 h為最佳共培養(yǎng)時(shí)間。

2.6 頭孢濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

轉(zhuǎn)化過(guò)程中，農(nóng)桿菌的控制效果對(duì)能否轉(zhuǎn)化成功十分重要。0～200 mg·L－1的 Cef濃度范圍對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果較差，染菌率均達(dá)100%，此時(shí)菌落布滿葉片，對(duì)受體傷害較大，誘導(dǎo)率為 0(表 7)。300～500 mg·L－1的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，農(nóng)桿菌生長(zhǎng)逐漸受到抑制，染菌率逐漸降低，誘導(dǎo)率升高。當(dāng)Cef濃度為500 mg·L－1，農(nóng)桿菌生長(zhǎng)完全受到抑制，誘導(dǎo)率為61.38%，因此選擇500 mg·L－1的頭孢濃度作為抑菌濃度，既能對(duì)農(nóng)桿菌起到較好的控制效果，又能保證外植體具有一定的分化率。

表6 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)矮牽牛轉(zhuǎn)化效率的影響Table 6 Frequency of the transformation of Petunia with different time of co-cultivation

表7 不同頭孢濃度對(duì)矮牽牛轉(zhuǎn)化效率的影響Table 7 Frequency of the transformation of Petunia with different Cef contentions

2.7 抗性植株的篩選

以未轉(zhuǎn)化株系為對(duì)照，于分化篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到黃化的愈傷，不能分化出不定芽，經(jīng)轉(zhuǎn)化的受體部分可以分化出綠色的抗性愈傷，但大部分沒(méi)有再分化(圖3A、圖3B)，少數(shù)的抗性愈傷可以分化得到抗性芽(圖3C)，平均轉(zhuǎn)化率僅有1.11%。將轉(zhuǎn)化得到的抗性芽接種于生根篩選培養(yǎng)基上，部分不定芽新葉先黃化，植株逐漸死亡，生長(zhǎng)狀況與未轉(zhuǎn)化株系類似(圖3E、F)。部分植株正常生根且長(zhǎng)勢(shì)較好，與未轉(zhuǎn)化株系生根培養(yǎng)類似(圖3D、G)。經(jīng)生根篩選，初步得到15株具有潮霉素抗性植株。

2.8 抗性植株的分子檢測(cè)

圖3 抗性植株篩選情況Fig.3 The status of screening resistant plants

圖4 抗性植株的PCR檢測(cè)Fig.4 The PCR detection of resistant seedlings

對(duì)15株抗性植株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。在PCR分析中，表達(dá)載體(陽(yáng)性對(duì)照)的質(zhì)粒DNA和12株轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA產(chǎn)生了IPT基因預(yù)期的目的片段;在未轉(zhuǎn)化的植物中沒(méi)有檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4)。初步確定5、10、15為假陽(yáng)性植株，其他為陽(yáng)性植株。

選擇長(zhǎng)勢(shì)較好的8個(gè)陽(yáng)性植株進(jìn)行RT-PCR檢驗(yàn)。植株的總RNA完整可用(圖5)。RT-PCR結(jié)果顯示，IPT基因目的片段在7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中擴(kuò)增出目的條帶，但在非轉(zhuǎn)化的植株中未發(fā)現(xiàn)(圖6)，表明IPT基因已經(jīng)整合到了7個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA中，在轉(zhuǎn)基因植株中至少在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。

圖5 轉(zhuǎn)基因株系的總RNAFig.5 The total RNA of transgenic lines

圖6 轉(zhuǎn)基因株系的RT-PCR檢測(cè)Fig.6 The RT-PCR detection of transgenic lines

3 結(jié)論與討論

有關(guān)矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化的研究已有很多報(bào)道，但由于遺傳轉(zhuǎn)化效率的基因型依賴性強(qiáng)，故不同品種其研究結(jié)果也不同。影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素主要有預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和延遲培養(yǎng)等［13］。若轉(zhuǎn)化前不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，外植體處于受傷狀態(tài)而十分敏感，直接被菌液侵染會(huì)導(dǎo)致葉片因抵抗力差而無(wú)法正常生長(zhǎng)甚至死亡。適當(dāng)?shù)念A(yù)培養(yǎng)一方面可促進(jìn)細(xì)胞分裂，提高外源基因的短期表達(dá)和穩(wěn)定整合率，另一方面可篩選掉污染的外植體，且使外植體適應(yīng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件［14］。農(nóng)桿菌的侵染濃度和侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程至關(guān)重要，菌液濃度過(guò)高會(huì)使葉片產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)，導(dǎo)致在培養(yǎng)中逐漸褐化甚至死亡，侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，葉片外植體會(huì)由于農(nóng)桿菌毒害而失去分化能力;菌液濃度過(guò)低、侵染時(shí)間過(guò)短，則減少了T-DNA的整合概率而使轉(zhuǎn)化率降低。共培養(yǎng)是轉(zhuǎn)化過(guò)程中十分重要的環(huán)節(jié)，農(nóng)桿菌附著在葉片的受傷部位不能立即轉(zhuǎn)化，只有經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)墓才囵B(yǎng)才能完成目的基因向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而整合到植物基因組的過(guò)程［15］。本研究以矮牽?！妨帧療o(wú)菌植株葉片為外植體，通過(guò)對(duì)比分析不同處理下的侵染效果，篩選出適合于矮牽?！妨帧庵搀w的最適轉(zhuǎn)化條件:預(yù)培養(yǎng)2 d，農(nóng)桿菌侵染濃度為 OD600=0.5，侵染時(shí)間3 min，共培養(yǎng)36 h。侵染完成后的延遲培養(yǎng)階段需要用到選擇抗生素和抑菌抗生素，在前人的研究中多采用卡那霉素(Kana)和潮霉素(Hey)作為選擇抗生素［6，16］，頭孢霉素(Cef)作為抑菌抗生素。本研究中，矮牽牛‘梅林’葉片分化及生根對(duì)潮霉素濃度比較敏感，2 mg·L－1的Hey就能完全抑制矮牽牛‘梅林’葉片分化，4 mg·L－1的Hey就可以抑制不定根的產(chǎn)生，所以選擇2 mg·L－1的Hey作為最適的分化篩選濃度，4 mg·L－1的Hey作為最適的生根篩選濃度。生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化過(guò)程中有效控制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)是轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵，但抑菌劑不僅對(duì)農(nóng)桿菌有抑制作用，也會(huì)影響外植體的分化及生長(zhǎng)，抑菌劑的使用濃度以完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)而不影響外植體分化為宜。孫艷香［17］等研究發(fā)現(xiàn)，300 mg·L－1的 Cef為‘交響曲’系列矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化適宜的脫菌濃度。而本試驗(yàn)中，500 mg·L－1的Cef才可以達(dá)到很好的抑菌效果。

IPT基因與細(xì)胞分裂素合成有關(guān)，前人研究中，轉(zhuǎn)IPT基因植株會(huì)發(fā)生形態(tài)上的變化。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生根培養(yǎng)，根系萌發(fā)時(shí)間、生根率及根系生長(zhǎng)狀況與未轉(zhuǎn)化植株相似，說(shuō)明IPT基因未抑制根系的生長(zhǎng)。以轉(zhuǎn)基因植株莖段為外植體增殖培養(yǎng)，增殖率明顯提高，可能與IPT基因促進(jìn)CTK合成有關(guān)。觀察矮牽牛無(wú)菌苗的生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株易在葉腋處萌發(fā)新芽，分枝增加，在轉(zhuǎn)基因山椒等研究中也有相似的形態(tài)變化［18］。綜上，IPT基因具有增加矮牽牛分枝，矮化植株等功能，且不影響根系的萌蘗。此外，大量研究表明，IPT基因具有提高植株抗性、延長(zhǎng)花期、延緩衰老、提高產(chǎn)量等作用，因此對(duì)IPT基因在矮牽牛上的功能表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。