劉婉迪，王 威，謝 倩，陳清西

溫度是影響植物生長發(fā)育的重要因素，不適宜的溫度極易影響植物的生理代謝，由于細胞膜對溫度有較高的靈敏性［1］，過高的溫度會造成細胞膜組織結構性損傷［2］。J.K.Raison［3］等提出膜脂相變理論后，許多研究證明原生質膜透性的變化主要在于質膜的變化［4-5］。因此，通過測定植物組織電解質外滲率變化情況，可以判斷植物是否受到高溫脅迫以及脅迫程度。電導法配合Logistic方程計算植物高溫半致死溫度(LT50)的測定方法簡便、靈敏，已應用于馬鈴薯［6-7］、油茶［8］、紫花苜蓿［9］、景天植物［10］、梨［11-12］、菊花［13］、白楊［14］、核桃［15］等多種植物材料，認為其能夠準確地對植物耐寒和耐熱性作出正確的判斷。杜鵑(Rhododendron)是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑屬的常綠花灌［16］。杜鵑品種繁多、花色豐富，具有較高的觀賞與經濟價值，其生長適宜溫度為12～25℃，多分布于較高海拔地區(qū)。目前栽培的大多數(shù)杜鵑優(yōu)良品種的耐熱性較差，溫度超過35℃時，新梢和新葉生長緩慢，進入半休眠狀態(tài)［17］，夏季高溫成為制約其生長發(fā)育的主要環(huán)境因子。福建省夏季炎熱潮濕，最高氣溫可達40℃，限制了大量優(yōu)良杜鵑品種在園林綠化中的應用。因此，篩選和選育耐熱杜鵑品種，對于擴大其在園林綠化的應用具有重要意義。本研究通過在福建省多個地區(qū)調查，選擇9個福建地區(qū)暢銷的杜鵑品種進行高溫脅迫處理，利用電導法配合Logistic方程，求得高溫半致死溫度(LT50)、細胞傷害率，而后結合人工氣候箱模擬高溫脅迫觀察這些品種的表型變化、計算相應的褐變指數(shù)，對其進行正確性驗證，從而對9個品種杜鵑進行耐熱排序，篩選出較適宜在福建地區(qū)園林綠化中應用的耐熱品種，為生產應用提供理論依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料

9個供試杜鵑品種(圖 1)，由永根杜鵑花培育有限公司提供。試驗于2016年3月在福建農林大學園藝設施溫室內進行。挑選4年生扦插苗，栽植于塑料花盆中(長×寬×高為20 cm×20 cm×30 cm)，于溫室中適應性栽培3個月后，選取長勢一致、無病蟲害的植株進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 細胞傷害率與高溫半致死溫度的測定與計算 細胞傷害率的測定參照岑維亞［18］的方法。處理溫度與細胞傷害率用Logistic方程:y=k/(1+ae－bt)擬合，方程中y代表細胞傷害率，t代表處理溫度，k，a，b為方程參數(shù)，k為細胞傷害率的飽和容量，b表示x與y之間的函數(shù)關系，a反映方程曲線與原點之間的相對位置關系［19］。為了確定a、b的值，將Logistic方程:y=k/(1+ae－bt)進行線性化轉化處理，ln［(k－y)/y］=lna－bt，令 y1=ln［(k－ y)/y］，則轉化為細胞傷害率(y1)與處理溫度(t)的直線方程。求回歸方程的二階導數(shù)，并令其等于零，即可獲得曲線拐點d2y/d2x的x值，即 ln a/b，其值為高溫半致死溫度(LT50，℃)。

1.2.2 高溫脅迫條件下表型指標的觀測 將上述盆栽扦插苗置于人工氣候箱中，脅迫溫度為50℃(晝/夜)，光照強度為 150 μmol·m－2·s－1，每個處理3株，重復3次。相對濕度90%～95%，連續(xù)處理直至所有植株葉片枯萎，每12 h拍照和統(tǒng)計數(shù)據(jù)。脅迫期間時刻關注土壤水分的變化，及時澆水，防止干旱導致的脅迫，影響數(shù)據(jù)真實性。根據(jù)李英慧［20］的方法稍作改變計算葉片褐變指數(shù)，將葉片的褐變狀態(tài)分為6級(表1)。統(tǒng)計褐變指數(shù)=［∑(褐變級值×相應褐變級值株數(shù))/(總株數(shù)×褐變最高級值)×100%］。

1.2.3 統(tǒng)計分析法 利用 SPSS 19.0和 Graphpad prism7.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與聚類分析，數(shù)值均以平均值±標準差表示。統(tǒng)計方法采用Duncans New Multiple Range test(P＜0.05)和 One-Way ANOVA。

2 結果與分析

2.1 葉片細胞傷害率與脅迫溫度的關系

當植物受到脅迫時，葉片細胞膜遭到破壞、電解質外滲，導致植物細胞浸提液的電導率增大。一般認為植物耐熱性與高溫脅迫后細胞浸提液的電導率呈負相關。在不同溫度處理條件下，隨著溫度的升高，9個品種葉片的傷害率呈現(xiàn)“緩慢增加-急劇增加-緩慢增加”的趨勢，即典型的“S”形曲線。

圖1 9個參試杜鵑品種表型Fig.1 Morphological characteristics of 9 Rhododendron cultivars

表1 杜鵑葉片褐變指數(shù)分級Table 1 Grades of leaf browning index of Rhododendron

在40～45℃區(qū)間內，9個杜鵑品種的細胞傷害率增加緩慢，表明此溫度區(qū)間內，杜鵑葉片能自主調節(jié)并且維持細胞穩(wěn)定;在45～50℃溫度區(qū)間時，9個品種的相對電導率均呈現(xiàn)快速上升趨勢，其中‘霞紅’的增幅最大為 96.75%，‘天章’的增幅最小(39.16%)?！畼s’和‘霞紅’在50℃水浴處理后，細胞傷害率達到 90%以上;‘白丹麥’、‘粉五寶’、‘春詩’和‘大青蓮’在55℃時，細胞傷害率達到90%以上;而‘石巖’、‘琉球紅’和‘天章’在60℃時，細胞傷害率達到90%以上(圖2)。

圖2 杜鵑各品種細胞傷害率與處理溫度間的關系Fig.2 Relationships between cell injured rate treatment and temperature in Rhododendron cultivars

2.2 高溫半致死溫度的確定

計算得出的9個杜鵑品種的轉化細胞傷害率和處理溫度間的關系見圖3?？梢钥闯?，杜鵑在不同溫度(t)下的細胞轉化傷害率(y1)的分布趨近一條直線(P＜0.01)，說明 y1與 t之間的關系用Logistic方程是合適的。高溫半致死溫度與杜鵑耐熱性呈正相關，9個品種的高溫半致死溫度范圍在46～54℃，耐熱性排序依次為:‘石巖’＞‘琉球紅’＞‘白丹麥’＞‘天章’＞‘春詩’＞‘大青蓮’＞‘粉五寶’＞‘御代之榮’＞‘霞紅’。其中高溫半致死溫度最高的品種為‘石巖’，53.84℃，最低的品種為‘霞紅’，46.92℃，與‘石巖’相差7℃左右，具有較明顯的差異(表2)。

圖3 杜鵑各品種轉化細胞傷害率與處理溫度間的關系Fig.3 Relationship between converted rate of injured cells and treatment temperature in Rhododendron cultivars

表2 杜鵑各品種高溫下相對電導率回歸方程及高溫半致死溫度(LT50)Table 2 Logistic equations of relative electrolyte leakage and their high semi-lethal temperature(LT50)of Rhododendron cultivars

2.3 高溫脅迫時長對杜鵑各品種葉片褐變指數(shù)和表型的影響

不同品種在一定時間范圍內隨著高溫脅迫時間的延長，葉片褐變指數(shù)呈上升的趨勢，在12 h脅迫后，‘霞紅’大約50%左右葉片完全枯萎。當脅迫時間達到24 h時，‘霞紅’完全死亡，其他8個品種葉片均遭受不同程度的損傷，葉片逐漸由Ⅲ級損傷向Ⅳ級和Ⅴ級損傷轉變。當脅迫時間達到24 h時，‘大青蓮’、‘粉五寶’和‘御代之榮’完全死亡，剩余6個品種葉片大多處于Ⅴ級褐變狀態(tài)。當36 h脅迫后，‘天章’、‘白丹麥’和‘春詩’全部死亡，‘石巖’和‘琉球紅’均處于Ⅴ級和Ⅵ級脅迫狀態(tài)。當48 h脅迫后，‘石巖’和‘琉球紅’完全死亡。通過褐變指數(shù)以及表型變化可對供試品種的耐熱性進行排序:‘石巖’＞‘琉球紅’＞‘天章’＞‘白丹麥’＞‘春詩’＞‘大青蓮’＞‘粉五寶’＞‘御代之榮’＞‘霞紅’。結合褐變指數(shù)可知，一定的高溫處理下，隨著高溫脅迫時間的增長，供試各品種葉片對高溫抵抗能力不同，說明不同杜鵑品種葉片細胞膜對高溫脅迫的反應有差異，對高溫傷害的響應不同;同一品種隨著處理時間的延長，葉片的褐變指數(shù)逐漸上升，但上升速度有不同，表明高溫對其的傷害有一個躍變過程(圖4、圖5)。

2.4 不同品種耐熱性的聚類分析

將9個杜鵑品種的高溫半致死溫度和褐變指數(shù)數(shù)據(jù)經標準化轉換后，采用平方歐氏距離，用離差平方和法對杜鵑不同品種的耐熱性進行了系統(tǒng)聚類分析(圖6)，在歐式距離2.50處可將9個品種分為3類，第Ⅰ類群包括:‘石巖杜鵑’、‘琉球紅’為強耐熱品種，平均半致死溫度為53.28℃;第Ⅱ類包括:‘天章’、‘春詩’、‘白丹麥’和‘大青蓮’為中等耐熱品種，平均半致死溫度為51.49℃;第Ⅲ類包括:‘粉五寶’、‘御代之榮’和‘霞紅’，平均半致死溫度為47.60℃。

3 結論與討論

圖5 高溫脅迫時長對杜鵑各品種表型的影響Fig.5 Effects of different heat treatment time on morphological characteristics in Rhododendron cultivars

圖6 杜鵑各品種的耐熱性聚類分析Fig.6 Cluster analysis of heat tolerance in Rhododendron cultivars

逆境脅迫導致植物細胞質膜選擇性喪失，電解質和某些有機物大量滲漏［21］。植物細胞膜的穩(wěn)定性是其抗逆性鑒定的重要指標，有研究表明高溫脅迫下的植物變異與其本身的表現(xiàn)一致［12］。以細胞傷害率擬合Logistic方程計算得到的高溫半致死溫度(LT50)可較準確地反映植物的耐熱性差異［22］，該方法簡單準確，已有效地在多個植物中得到證實［5，22-25］。但是王文舉［26］等認為由于半致死溫度和細胞傷害率是在離體條件下測定的，不一定能確切反映出植物的耐熱性。因此，本試驗通過采用人工氣候箱集中高溫脅迫觀測9個品種的表型以及比較葉片的褐變指數(shù)進一步對9個品種的耐熱性進行排序，以期驗證高溫半致死溫度對杜鵑耐熱性排序的準確性。研究表明，高溫脅迫后杜鵑的細胞傷害率曲線呈現(xiàn)“S”形，通過顯著性檢驗，符合Logistic方程。高溫半致死溫度在褐變指數(shù)的驗證下，能客觀反映杜鵑品種的耐熱性，且所得到的耐熱性排序與半致死溫度排序一致，說明通過計算高溫半致死溫度來判斷杜鵑的耐熱能力差異是有效的。通過對高溫半致死溫度以及對人工氣候箱的表型分析相結合，可以較為合理的為杜鵑的耐熱性育種及其在福建低海拔地區(qū)的應用提供理論依據(jù)。其中‘石巖’和‘琉球紅’具有較強的耐熱性，可以嘗試應用于福建地區(qū)的園林綠化中。

隨著脅迫溫度的增加，胞質外滲非持續(xù)進行，外滲電導值變化在總趨勢升高的基礎上有變緩或急劇增加的情況［27］。本試驗中，9個品種杜鵑在40℃和45℃時，其細胞傷害率值變緩或下降，是植物在逆境傷害初期的自我保護作用，這時細胞膜的損傷是可逆的，可以通過自主調節(jié)維持細胞膜的穩(wěn)定性進行主動運輸，從而調整胞質的外滲，導致外滲電導值變緩或下降。但通過對測定品種葉片的電導值變化幅度可見，這種自我保護在不同杜鵑品種上表現(xiàn)不同，與不同品種的細胞對高溫的應激反應的不同有關［11］。與張文娟［10］等對景天植物的耐熱性的研究以及石永紅［5］等對黑麥草的耐熱性的研究中一致。而當超過一定溫度范圍時，供試杜鵑的細胞膜受到嚴重損傷，細胞膜可逆的損傷開始向不可逆的損傷轉變［26］。且不同品種的杜鵑細胞傷害率急劇增加的轉折點均不同。在50℃和55℃脅迫后，9個品種的細胞傷害率均呈現(xiàn)緩慢增加或保持不變的趨勢，說明此時質膜已經遭到破壞，主動運輸功能完全喪失，電導值下降。

綜上所述，高溫下，隨著高溫脅迫時間的增長，供試各品種葉片對高溫抵抗能力不同，且溫度對其傷害有一個躍變過程。褐變指數(shù)所得出的耐熱性與高溫半致死溫度所得到的耐熱性基本一致，說明高溫半致死溫度可以作為評價杜鵑耐熱性的準確方法。根據(jù)高溫半致死溫度和褐變指數(shù)對杜鵑的耐熱性進行系統(tǒng)聚類分析，9個品種可分為3類，第Ⅰ類群包括:‘石巖’、‘琉球紅’為強耐熱品種;第Ⅱ類包括:‘天章’、‘春詩’、‘白丹麥’和‘大青蓮’為中等耐熱品種;第Ⅲ類包括:‘粉五寶’、‘御代之榮’和‘霞紅’為不耐熱品種。