王大瑋，唐紅燕，段安安，周 軍，汪元超，蔡年輝，許玉蘭，李思廣

思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis)是我國云南省特有樹種，是針葉樹種中最速生的種類之一，是一種以用材為主并具有多種用途的植物，有很高的開發(fā)利用價值［1-2］。其木材廣泛用于建筑、造紙、家具制造等行業(yè)，富含優(yōu)良品質(zhì)的松脂，思茅松松脂是我國最重要的松脂資源之一［3-5］。

遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建成為現(xiàn)代遺傳學(xué)研究中一個非常重要且應(yīng)用較為廣泛的領(lǐng)域［6］，同時還是實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種與數(shù)量性狀定位的必要手段［7-8］。作圖群體的建立不但為遺傳作圖提供了研究材料，而且是構(gòu)建遺傳圖譜的關(guān)鍵步驟［9］。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)憑借其簡便、穩(wěn)定的特點，目前已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳相似系數(shù)的分析研究中［10-11］。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展各類植物的遺傳作圖群體相繼建立［12-16］，為這些植物的遺傳圖譜構(gòu)建和數(shù)量性狀定位奠定了堅實的基礎(chǔ)。

在對思茅松進(jìn)行人工雜交和苗木培育的基礎(chǔ)之上，測定雜交后代各單株的田間表型性狀，并結(jié)合親本SRAP標(biāo)記分析，選擇出子代在田間表型性狀和親本在DNA多態(tài)性水平上差異均較大的分離群體，從而為今后思茅松遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建以及進(jìn)行相關(guān)重要性狀定位提供了研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雜交親本 從性狀差異較大的11個思茅松優(yōu)良無性系中各選擇1株作為雜交親本。其中父本5株:JG1(高產(chǎn)脂)、NR7(速生高產(chǎn))、LC3(高產(chǎn)脂)、ZY1(速生高產(chǎn))、PW2(高產(chǎn)脂);母本 6株:PW12(速生高產(chǎn))、LC9(速生高產(chǎn))、JG7(高產(chǎn)脂)、JD5(高產(chǎn))、PW3(速生)、SM11(速生)。

1.1.2 雜交F1群體 將11個茅松優(yōu)良無性系按照析因交配設(shè)計，共組成了30個雜交組合進(jìn)行人工雜交，利用播種育苗的方法對所獲得的雜交種子進(jìn)行繁殖，通過培育最后得到了9個較大的F1全同胞家系，分別命名為1～9號家系(表1)。獲得家系編號，括號內(nèi)為群體數(shù)量。

表1 F1家系來源及編號Table 1 Number of F1families

1.2 方法

1.2.1 田間表型性狀的調(diào)查及分析 1年生苗木高生長停止時，對9個F1家系每株測定其田間表型性狀。測定性狀包括苗高生長量、地徑生長量、針葉長、針葉粗、葉梢長、針葉長/針葉粗、針葉長/葉梢長。對9個F1家系的各性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS13.0軟件對各家系的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并計算變異系數(shù)。

1.2.2 親本SRAP分析 采集11個親本的幼嫩針葉，利用改良的CTAB法對思茅松基因組DNA進(jìn)行提取。根據(jù)已建立的SRAP反應(yīng)體系［1］，在100對引物組合(表2)中篩選出15對引物組合對親本進(jìn)行多態(tài)性檢測，引物組合分別為:Me1-Em4、Me2-Em9、Me4-Em9、Me5-Em10、Me6-Em2、Me6-Em3、Me6-Em5、Me6-Em9、Me7-Em1、Me7-Em7、Me8-Em4、Me9-Em6、Me9-Em7、Me9-Em9、Me10-Em3。在思茅松SRAP聚丙烯酰胺電泳圖譜上選擇清晰可見且可重復(fù)的條帶，轉(zhuǎn)換為“0”、“1”矩陣，利用 NTSYS pc version 2.10e軟件對各親本間的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行計算和UPGMA聚類分析。

1.2.3 作圖群體的選擇 在各家系生長性狀變異系數(shù)分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合11個親本的SRAP遺傳相似系數(shù)分析，最后在9個備選群體中選取F1代表型及親本DNA水平均差異較大的分離群體作為構(gòu)建思茅松遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的作圖群體。

表2 思茅松SRAP引物序列Table 2 Sequences of primers used in SRAP-PCR system

2 結(jié)果與分析

2.1 候選作圖群體表型性狀的變異

由表3可知，9個群體各性狀的平均變異系數(shù)在 22.47%～34.48%，9 號家系最高，達(dá) 34.48%，1、2、5、8號家系的平均變異系數(shù)均＞25%，分別排在2～5位，6、4、3、7 號家系的平均變異系數(shù)均＜25%，分別排在6～9位。9號家系的地徑、針葉粗的變異系數(shù)都最大，針葉長及針葉長/針葉粗的變異系數(shù)都排在第2，苗高的變異系數(shù)第3。排在第2的是平均變異系數(shù)為27.09%的1號家系，其針葉長的變異系數(shù)最大，苗高的變異系數(shù)排在第2，其他指標(biāo)的變異系數(shù)均較小。排在第3的是2號家系，其苗高的變異系數(shù)最大，地徑、變異系數(shù)排在第3，其他性狀的變異系數(shù)都較低。

表3 不同家系生長性狀的變異系數(shù)Table 3 Variation coefficient of the growth traits in families %

2.2 親本SRAP分析

利用SRAP標(biāo)記對11個雜交親本進(jìn)行多態(tài)性檢測(圖1)，15對引物總共擴(kuò)增出132個位點帶數(shù)，其中，每對引物擴(kuò)增出7～12個不等位點條帶數(shù)，總多態(tài)性位點條帶數(shù)為129個，多態(tài)性帶比率為95.45%;每對引物平均擴(kuò)增位點條帶為8.8個，其中多態(tài)性位點條帶的個數(shù)是8.4。擴(kuò)增多態(tài)性位點條帶數(shù)最多的引物對Me9-Em7為12個條帶。引物擴(kuò)增多態(tài)性位點條帶最少的引物對是Me4-Em9、Me6-Em3、Me6-Em5、Me9-Em9，7 個條帶(表4)。

圖1 引物組合M9-E7擴(kuò)增出的SRAP圖譜在11個親本間的多態(tài)性分布Fig.1 The SRAP polymorphisms amplificated by primer combination M9-E7 from 11 parents

對11個雜交親本的遺傳相似系數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，各親本間的遺傳相似系數(shù) 0.471 9～0.854 8(表5)，9個家系親本間遺傳相似系數(shù)大小順序分別為:2號＞3號＞8號＞4號＞6號＞1號＞7號＞9號＞5號。其中2號家系的親本PW12與PW2間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.854 8，說明2親本間的親緣關(guān)系較近;5號家系的親本JG7與ZY1間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.426 1;9號家系的親本SM11與JG1間的遺傳相似系數(shù)第二小，為0.471 9。表明這2個組合親本間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表4 SRAP引物多態(tài)性分析Table 4 Analysis of polymorphism SRAP primers

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行聚類分析繪制遺傳聚類圖。由圖2可以看出，在遺傳相似系數(shù)為0.577 2的水平上進(jìn)行劃分，11個雜交親本可分為5組:第1組以JG7單獨為1組;第2組SM11單獨為1組;第3組NR7號單獨為 1組;第 4組以 ZY1、PW2、PW12、PW3這4個親本成為1組，其中PW2和PW12親緣關(guān)系最近;第5組以JG1、LC3、LC9、JD5這4個親本成為1組，其中LC3和LC9親緣關(guān)系較近。

2.3 作圖群體的選擇

9號家系的平均變異系數(shù)最高，從田間表型性狀變異情況來看是十分理想的候選作圖群體，但作圖群體的確定，還需要從DNA水平考慮其親本間的遺傳差異。從SRAP標(biāo)記分析結(jié)果來看，5號家系的親本JG7與ZY1的遺傳相似系數(shù)最小，但5號家系田間表型性狀平均變異系數(shù)較低，不是適宜的作圖群體。9號家系的親本SM11與JG1間的遺傳相似系數(shù)僅次于5號家系，其親本間的親緣關(guān)系較 遠(yuǎn)。綜合考慮，選擇出在F1表型及親本DNA水平均差異較大的9號家系作為構(gòu)建思茅松遺傳連鎖圖譜的分離群體。

表5 11個親本間的遺傳相似系數(shù)Table 5 Genetic similarity coefficient between 11 parents

圖2 11個親本的遺傳聚類圖Fig.2 Dendrogram of 11 parents

3 結(jié)論

利用11個思茅松優(yōu)良無性系作為雜交親本，人工控制授粉后獲得了9個較大的分離群體。在對9個思茅松F1家系田間表型性狀變異分化程度分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用15對SRAP引物組合對11個親本間在分子水平的多態(tài)性進(jìn)行了檢測，最終選取了子代表型及親本DNA水平均差異較大的9號家系作為構(gòu)建思茅松遺傳連鎖圖譜的分離群體。為思茅松遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、重要經(jīng)濟(jì)性狀的定位和其他分子遺傳學(xué)方面的研究提供了寶貴的材料。