張馨月，付世東

(陜西省延安市人民醫(yī)院，陜西 延安 716000)

放射性肺炎是胸部放療的最常見并發(fā)癥之一，不及時(shí)有效治療將不可逆發(fā)展為放射性肺纖維化，嚴(yán)重威脅患者生命安全。目前，臨床對(duì)于放射性肺炎以大劑量糖皮質(zhì)激素等藥物治療為主，但部分患者療效不佳，且由于激素類藥物不良反應(yīng)過(guò)多，患者常無(wú)法耐受長(zhǎng)期治療[1-2]。因此，臨床如何有效治療放射性肺炎是醫(yī)務(wù)工作者亟須解決的重大問(wèn)題。利肺片具有驅(qū)癆補(bǔ)肺、鎮(zhèn)咳祛痰等功效，廣泛用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療[3-4]，但目前該藥治療放射性肺炎的探討極少。為此，筆者觀察了利肺片對(duì)放射性肺炎小鼠肺部炎性因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，期望為該疾病的臨床治療提供一定的參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 AS2016型組織包埋機(jī)(北京多得生物科技公司)，PO-7型電子顯微鏡(南京市第三精密儀器有限公司)，SH-KU-9型放射治療機(jī)(上海特種醫(yī)用器械廠)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素-12(IL-12)檢測(cè)所需試劑盒(武漢博士德公司)。蘇木精-伊紅(HE)及梅森(Masson)染色試劑盒與抗體(美國(guó)天地公司)。地塞米松(美國(guó)Sigma公司)，利肺片(北京同仁堂，國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020023)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 3月齡C57BL/6雌鼠(清潔級(jí))60只，體質(zhì)量18～21 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并由該校藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室代飼養(yǎng)，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(陜)2016-1119。實(shí)驗(yàn)前對(duì)小鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼料飲水不限制，室溫及自然光照。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后將上述小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、地塞米松組、利肺片高劑量組、利肺片中劑量組及利肺片低劑量組，每組10只。

1.3造模方法 參考文獻(xiàn)[5]中方法，以10%水合氯醛麻醉各組小鼠，空白組麻醉后不進(jìn)行放射；模型組及各給藥組小鼠麻醉后取仰臥位，將其四肢綁于放射治療床上，胸部曝露并屏蔽其他部位，采用放射機(jī)照射小鼠胸部前肢兩腋窩中點(diǎn)，照射參數(shù)為36 MV光子，范圍3.0 cm×1.8 cm，劑量18 Gy/次，1次/d，連續(xù)照射30 d。

1.4給藥劑量與方法 根據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道換算劑量，小鼠劑量(mg/kg)=12.3×成人劑量(mg/kg)，成人體質(zhì)量按照60 kg計(jì)。根據(jù)地塞米松說(shuō)明書人體給藥劑量為12 mg/d，體質(zhì)量以60 kg計(jì)，故小鼠劑量=12/60×12.3=2.46 mg/kg。根據(jù)利肺片說(shuō)明書人體給藥劑量為2.7 g/d，體質(zhì)量以60 kg計(jì)，故小鼠劑量=2.7/60×12.3=0.55 g/kg，故選用0.55 g/kg作為中劑量，同時(shí)選用2倍劑量為高劑量(1.1 g/kg)，1/2倍劑量為低劑量(0.252 g/kg)。每天照射結(jié)束1 h后，地塞米松組給予地塞米松2.46 mg/kg灌胃，利肺片高、中、低劑量組分別給予利肺片1.1 g/kg、0.55 g/kg、0.252 g/kg灌胃，空白組及模型組僅灌胃等量生理鹽水。

1.5標(biāo)本采集與處理 最后一次給藥結(jié)束8 h后，以頸椎脫臼法處死各組小鼠，開胸取雙側(cè)肺，將右側(cè)肺均分為2份，以4%多聚甲醛固定，置于-20 ℃冰箱保存，將左側(cè)肺以玻璃勻漿器制備成組織勻漿，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1氧化應(yīng)激及炎性因子指標(biāo)檢測(cè) 取制備好的肺組織勻漿，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)GSH-Px、SOD、CAT水平和炎性因子IL-6、TNF-α、IL-12水平。

1.6.2肺組織病理觀察 ①取小鼠一半右側(cè)肺組織，包埋并切片，采用常規(guī)HE染色后利用光鏡觀察其病理變化情況，選擇5個(gè)觀察視野。通過(guò)觀察肺泡炎面積與總視野面積的比例，并利用Szapiel半定量法[7]評(píng)價(jià)各組小鼠肺泡炎情況，其中無(wú)肺泡炎記1分；肺泡炎面積/總視野面積<0.2為輕度肺泡炎，記2分；20%≤肺泡炎面積/總視野面積<50%為中度肺泡炎，記3分；肺泡炎面積/總視野面積≥50%為重度肺泡炎，記4分。②取小鼠另一半右側(cè)肺組織，包埋并切片，采用Masson試劑染色后利用光鏡觀察其肺部膠原染色情況，選擇5個(gè)觀察視野。采用Szapiel半定量法[7]評(píng)價(jià)各組小鼠肺部膠原沉積情況，其中無(wú)膠原沉積記1分；膠原沉積面積/總視野面積<20%為輕度膠原沉積，記2分；20%≤膠原沉積面積/總視野面積<50%為中度膠原沉積，記3分；膠原沉積面積/總視野面積≥50%總視野面積為重度膠原沉積，記4分。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠肺組織勻漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 空白組、地塞米松組、利肺片各劑量組小鼠肺組織勻漿中GSH-Px、SOD、CAT水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，但地塞米松組及利肺片各劑量組上述各指標(biāo)水平均明顯低于空白組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺組織勻漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

注：①與模型組比較，P<0.05；②與空白組比較，P<0.05。

2.2各組小鼠肺組織勻漿中炎性因子指標(biāo)水平比較 空白組、地塞米松組、利肺片各劑量組小鼠肺組織勻漿中IL-6、TNF-α、IL-12水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，但地塞米松組及利肺片各劑量組上述各指標(biāo)水平均明顯高于空白組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肺組織勻漿中炎性因子指標(biāo)水平比較

注：①與模型組比較，P<0.05；②與空白組比較，P<0.05。

2.3各組小鼠肺組織HE染色情況 空白組均無(wú)肺泡炎改變；模型組多為中度與重度肺泡炎改變，主要表現(xiàn)為中度及中度以上炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；地塞米松組和利肺片各劑量組則多為輕度肺泡炎改變，主要表現(xiàn)為輕度及中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

2.4各組小鼠肺組織Masson染色情況 空白組中無(wú)膠原沉積；模型組主要為肺組織中度及重度膠原沉積改變；地塞米松組和利肺片各劑量組多為輕度膠原沉積改變。見圖2。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.5各組小鼠肺泡炎及膠原沉積評(píng)分比較 空白組、地塞米松組和利肺片各劑量組小鼠肺泡炎評(píng)分和膠原沉積評(píng)分均明顯低于模型組(P均<0.05)，但地塞米松組和利肺片各劑量組肺泡炎評(píng)分和膠原沉積評(píng)分均明顯高于空白組(P均<0.05)。見表3。

3 討 論

放射性肺炎是由于肺癌、乳腺癌、惡性淋巴瘤、食管癌等胸部腫瘤經(jīng)放射治療后，在放射視野中患者正常的肺組織受到射線損傷而引起的一系列炎癥反應(yīng)[8-9]。炎癥反應(yīng)發(fā)生后，患者肺部組織凋亡途徑與局部炎癥級(jí)聯(lián)效應(yīng)被激活，局部氧化應(yīng)激紊亂，上述作用均可加速肺部成纖維細(xì)胞的不斷分裂與增殖，最終導(dǎo)致患者肺部出現(xiàn)大量膠原蛋白沉積，形成肺纖維化，嚴(yán)重威脅患者生命健康[10]。目前，臨床對(duì)于該疾病的治療尚無(wú)權(quán)威方法，主要為對(duì)癥治療，延緩疾病的進(jìn)展。

圖2 各組小鼠肺組織Masson染色表現(xiàn)(×400)

注：①與模型組比較，P<0.05；②與空白組比較，P<0.05。

隨著現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的不斷發(fā)展，中藥治療放射性肺炎的研究越來(lái)越多。利肺片主要由五味子、百合、冬蟲夏草、枇杷葉、牡蠣、白芨、百部、甘草及蛤蚧等中藥組成，主要用于氣虛哮喘、咳痰、咯血、肺癆咳嗽及慢性氣管炎等多種呼吸內(nèi)科疾病的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，五味子中多糖可有效阻止肺膠原蛋白沉積[11]；百合中甾體皂苷類化合物具有較好的抗炎活性，能夠有效緩解肺部炎癥反應(yīng)[12]；枇杷葉中三帖酸則能夠有效清除體內(nèi)自由基，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。鑒于利肺片中主要成分具有一定的抗肺纖維化、抗炎及抗氧化應(yīng)激活性[14]，故本研究探討了該藥物治療放射性肺炎的價(jià)值。

既往研究表明，采用18 Gy的照射劑量對(duì)C57BL/6小鼠連續(xù)照射30 d后，小鼠可出現(xiàn)不同程度的放射性肺炎及肺纖維化改變，且該種小鼠放射后病死率較低，故是公認(rèn)的放射性肺炎首選模型[15-16]。在本研究中，空白組不予放射給藥，模型組僅進(jìn)行放射不給藥，能夠分別反映出小鼠健康狀態(tài)和放射性肺炎發(fā)病狀態(tài)。此外，由于肺纖維化是放射性肺炎的主要階段，隨著放射性肺炎病情的發(fā)展，其可逐漸發(fā)展為肺纖維化，而肺纖維化發(fā)生后很難逆轉(zhuǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)不僅采用HE染色觀察小鼠肺泡炎情況，還利用Masson染色對(duì)小鼠肺纖維化情況進(jìn)行了觀察。而在放射性肺炎的病理變化中，射線可造成正常肺組織中產(chǎn)生大量活性氧自由基，造成DNA損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化，從而啟動(dòng)一系列炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等基因活化的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，最終進(jìn)一步導(dǎo)致組織損傷，故測(cè)定照射后小鼠肺組織中氧化應(yīng)激因子及炎性因子含量，能夠有效反映藥物對(duì)照射后小鼠肺組織細(xì)胞的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利肺片各劑量組小鼠肺組織勻漿中GSH-Px、SOD、CAT水平均明顯高于模型組，IL-6、TNF-α、IL-12水平和肺泡炎評(píng)分、膠原沉積評(píng)分均明顯低于模型組，提示利肺片可有效改善放射所致局部氧化應(yīng)激紊亂，減輕肺部炎癥反應(yīng)，緩解肺纖維化，為利肺片治療放射性肺炎提供了一定參考依據(jù)。