鐘嘉穎，吳英英，勞夢曉，張小艷，王春麗，潘建華

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510182；2.廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心臨床血液流式細(xì)胞檢測中心，廣東 廣州 510005）

多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multiparameter flow cytometry，MFC）是兒童急性B淋巴細(xì)胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）免疫分型和微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）檢測的重要方法。MRD檢測可用于B-ALL患兒的療效判斷和預(yù)后評估。MFC是MRD檢測的關(guān)鍵，其難點(diǎn)在于對正常B系前體細(xì)胞與B-ALL腫瘤細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。CD123，即白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-3受體α鏈，是造血生長因子受體家族成員之一。CD123在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）中異常表達(dá)[1-3]，但在兒童B-ALL中的表達(dá)特點(diǎn)有待進(jìn)一步確認(rèn)。CD66c是癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）基因家族成員之一，屬非特異性交叉反應(yīng)性抗原，主要分布于粒細(xì)胞、結(jié)腸和肺上皮細(xì)胞中，在部分成人及早期B-ALL患兒中高表達(dá)[4-5]。本研究采用MFC對CD123和CD66c在141例B-ALL患兒中的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行分析，并探討二者在MRD監(jiān)測中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年6月—2017年6月送檢廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心臨床血液流式細(xì)胞檢測中心的初診B-ALL患兒標(biāo)本141例，患兒男80例、女61例，年齡4（1～14）歲，所有病例均經(jīng)世界衛(wèi)生組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)（morphology）、免疫學(xué)（immunology）、細(xì)胞遺傳學(xué)（cytogenetics）和分子生物學(xué)（molecular biology）分型（MICM分型）確診。另選取25例AML患者作為對照組，經(jīng)治療癥狀完全緩解后采集其骨髓標(biāo)本，所有標(biāo)本均含比例不等的正常增生B系前體細(xì)胞。

1.2 儀器與試劑

選用FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。單克隆抗體包括異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP） -Cy5.5、PE-Cy7、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）、APC-H7、V450和V500標(biāo)記的鼠抗人CD5、CD10、CD20、CD19、CD22、CD123、CD38、CD34、CD33、CD117、CD13、CD7、CD3、IgM、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）、CD45等，均購自美國BD公司。IntraPrep破膜劑購自法國Immunotech公司。溶血素為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 抗體標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)分析 將初診患兒骨髓有核細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×105/100 μL，采用多色直接免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行染色。每管加入100 μL標(biāo)本，染色前用10 μL小牛血清常溫封閉10 min，以阻斷Fc受體，加入相應(yīng)單抗，對細(xì)胞表面及胞質(zhì)內(nèi)的抗原進(jìn)行檢測。對照組骨髓淋巴細(xì)胞CD123和CD66c檢測方法同初診患兒。使用Diva軟件獲取0.6×105個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行分析，細(xì)胞表面及胞質(zhì)內(nèi)抗原檢測結(jié)果以表達(dá)＞20%為陽性。

1.3.2 CD123和CD66c在正常B系前體細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞中的表達(dá) 采用流式細(xì)胞儀檢測對照組經(jīng)治療癥狀完全緩解后的骨髓標(biāo)本，以CD45/SSC設(shè)門，當(dāng)CD45弱陽性、懷疑為正常增生B系前體細(xì)胞時(shí)，選取CD66c/CD123/CD34/CD10/CD19/CD38/CD45抗體組合，進(jìn)一步分析CD123和CD66c在正常B系前體細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.3.3 B-ALL患兒治療后MRD檢測 當(dāng)初診患兒抗原表達(dá)不同于對照組（CD123、CD58強(qiáng)表達(dá)，CD38、CD45陰性或弱表達(dá)，CD13、CD33和CD66c跨系表達(dá)）時(shí)，選取CD10/CD34/CD19/CD45做進(jìn)一步MRD抗體組合檢測。B-ALL患兒治療后骨髓標(biāo)本用Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，2 000×g離心20 min，吸出白膜層，再用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2遍，調(diào)節(jié)單個(gè)核細(xì)胞數(shù)至合適的量。每管加入100 μL標(biāo)本，用10 μL小牛血清常溫封閉10 min后加入相應(yīng)單抗，對細(xì)胞表面抗原進(jìn)行檢測，每管盡量多地獲取細(xì)胞（4×105～10×105個(gè)細(xì)胞），分析MRD水平，MRD≥0.01%為陽性，MRD＜0.01%為陰性，MRD＞5.00%為復(fù)發(fā)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以x± s表示，呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)，采用Spearman法分析相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD123和CD66c在正常B系前體細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

對照組正常B系前體細(xì)胞占有核細(xì)胞總數(shù)的[7.63（1.76～21.82）]%。根據(jù)CD19、CD10、CD34和CD45的表達(dá)特點(diǎn)可將正常B系前體細(xì)胞分為：（1）CD10熒光強(qiáng)度最強(qiáng)而CD45熒光強(qiáng)度較弱的細(xì)胞群，該細(xì)胞群CD34陽性，為較早期的B祖細(xì)胞（CD19+CD34+）；（2）CD10熒光強(qiáng)度較弱而CD45熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的細(xì)胞群，該細(xì)胞群CD34陰性，為較晚期的B系前體細(xì)胞（CD19+CD34-）。CD123在CD19+CD34+和CD19+CD34-上的表達(dá)水平分別為[0.46（0.00～2.47）]%和[0.10（0.10～1.07）]%，CD66c的表達(dá)水平分別為[0.42（0.00～1.65）]%和[0.21（0.10～1.21）]%。CD123和CD66c在正常B系前體細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞中均不表達(dá)。

2.2 CD123和CD66c在兒童B-ALL中的表達(dá)

141例B-ALL患兒中分別有6例、123例和12例為早期前體B-ALL（Pro-B-ALL）、普通B-ALL（Common-B-ALL）和前體B-ALL（Pre-B-ALL），其中CD123陽性88例（62.41%），CD66c陽性70例（49.65%），CD123和CD66c均陽性62例（43.97%），CD123或CD66c陽性96例（68.09%）。經(jīng)Spearman法相關(guān)性分析，CD123和CD66c與兒童B-ALL表達(dá)呈中度正相關(guān)（r=0.641，P＜0.01）。見表1。

2.3 MRD抗體組合檢測

CD123和CD66c在B-ALL腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)不同于正常B淋巴細(xì)胞（B系前體細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞），以抗原陽性率≥90%作為治療后MRD監(jiān)測的指標(biāo)。141例B-ALL患兒中，CD123或CD66c陽性共96例（68.09%），45例選擇CD123用于監(jiān)測，52例選擇CD66c用于監(jiān)測，選擇CD123和CD66c用于監(jiān)測的病例有35例，選擇CD123或CD66c用于監(jiān)測的病例有62例，覆蓋率為43.97%。監(jiān)測指標(biāo)除CD123和CD66c外，還包括CD38、CD45陰性或弱表達(dá)，CD58強(qiáng)表達(dá)，CD13、CD33跨系表達(dá)。見表2、圖1。

表1 CD123和CD66c在兒童B-ALL中的表達(dá)水平

表2 CD123和CD66c在B-ALL患兒MRD監(jiān)測中的應(yīng)用[例（%）]

圖1 CD123在B-ALL患兒MRD監(jiān)測中的應(yīng)用

3 討論

采用流式細(xì)胞術(shù)分析兒童B-ALL治療后MRD水平時(shí)，受化療或骨髓移植后骨髓增生期的影響，B-ALL患兒的骨髓中會出現(xiàn)造血B系前體細(xì)胞數(shù)量一過性增加的情況，此階段出現(xiàn)的CD19、CD10雙陽性群體來源于正常造血細(xì)胞克隆還是來源于惡性血細(xì)胞克隆，需謹(jǐn)慎判斷。目前，形態(tài)學(xué)方法較難區(qū)分正常B系前體細(xì)胞與B-ALL腫瘤細(xì)胞，且二者的免疫表型也十分相似，故B-ALL的MRD監(jiān)測主要依賴于正常B系前體細(xì)胞免疫表型存在明顯差別的抗原[6-7]。本研究結(jié)果顯示，141例B-ALL患兒中CD123表達(dá)陽性88例，陽性率為62.41%；CD66c表達(dá)陽性70例，陽性率為49.65%。然而，CD123和CD66c在骨髓正常增生B系前體細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞中均不表達(dá)。本研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果都顯示骨髓正常增生B系前體細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞均無CD123和CD66c表達(dá)[8-10]，提示CD123和CD66c均可作為兒童B-ALL的MRD監(jiān)測指標(biāo)。

用于B-ALL MRD監(jiān)測較好的指標(biāo)不僅需要在白血病細(xì)胞上特異表達(dá)，而且還要在化療后殘留腫瘤細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)。本研究MRD監(jiān)測結(jié)果顯示，CD123和CD66c表達(dá)均具有良好的穩(wěn)定性，無衰減或變?nèi)?，對CD123和CD66c陽性白血病細(xì)胞群的判斷和分析較為容易。經(jīng)與其他指標(biāo)（CD58、CD38、CD33和CD13）進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，CD33和CD13穩(wěn)定性不夠，復(fù)發(fā)時(shí)部分病例表達(dá)減弱或缺失，一些病例的CD58和CD38受熒光強(qiáng)度較正常B系前體細(xì)胞分界不明顯的影響，未能較好地對白血病細(xì)胞進(jìn)行辨別。因此，CD123和CD66c是兒童B-ALL MRD監(jiān)測穩(wěn)定、特異、敏感的指標(biāo)。

本研究中141例B-ALL患兒有96例CD123或CD66c陽性（陽性率為68.09%），CD123和CD66c共同用于MRD監(jiān)測的病例有35例，表明CD123和CD66c常共同表達(dá)于B-ALL白血病細(xì)胞表面，且經(jīng)Spearman法相關(guān)性分析，CD123和CD66c與兒童B-ALL呈中度正相關(guān)（r=0.641，P＜0.01）。因此，CD123和CD66c同時(shí)用于兒童B-ALL診斷和MRD監(jiān)測具有較好的準(zhǔn)確性。隨訪期間觀察到2例復(fù)發(fā)患兒，復(fù)發(fā)B-ALL腫瘤細(xì)胞表面CD123和CD66c表達(dá)強(qiáng)度與初診時(shí)一致，但由于治療后復(fù)發(fā)的病例數(shù)較少且隨訪時(shí)間較短，CD123和CD66c在MRD監(jiān)測中的穩(wěn)定性尚需通過增加病例和延長隨訪時(shí)間來進(jìn)行評估。本研究中CD123或CD66c用于MRD監(jiān)測的病例僅62例（覆蓋率為43.97%），需聯(lián)合其他多個(gè)篩選指標(biāo)進(jìn)行檢測，以提高M(jìn)RD監(jiān)測的覆蓋率，同時(shí)還可有效減少因化療導(dǎo)致部分患者免疫表型改變而出現(xiàn)的不真實(shí)監(jiān)測結(jié)果。