徐仿敏, 李海波, 魏萬里, 劉凌云, 李 強

(1. 江陰市公安局物證鑒定室, 江蘇 江陰 214431; 2. 常州市公安局物證鑒定所, 江蘇 常州 213001; 3. 無錫市公安局物證鑒定所, 江蘇 無錫 214001)

液液微萃取技術(liquid-liquid microextraction, LLME)是20世紀90年代Jeannot等[1]在傳統(tǒng)液液萃取的基礎上提出的新型樣品前處理技術。該技術經(jīng)過多年的發(fā)展,不斷改進,從最初的單滴液液微萃取(single drop microextraction, SDME)[1]到中空纖維液液微萃取(hollow-fiber-protected liquid-phase microextraction, HF-LPME)[2-4]、分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)[5-7],再到近年來基于可變親水性試劑的均相液液微萃取(switchable-hydrophilicity solvent homogeneous liquid-liquid microextraction, SHS-LLME)[8]。與傳統(tǒng)液液萃取相比,液液微萃取具有操作簡便、萃取效率高、富集效果好、耗時少、所需有機溶劑少等優(yōu)點,屬于環(huán)境友好型前處理技術。

SHS-LLME是2010年Jessop等[8]提出的綠色高效的萃取技術,該技術使用的萃取劑是一類可變的親水性試劑,主要包括二丙胺(dipropylamine, DPA)、三乙胺(triethylamine, TEA)、N,N-二甲基丁胺(N,N-dimethylbutylamine, DMBA)、N,N-二甲基環(huán)己胺(N,N-dimethylcyclohexylamine, DMCHA)等[9,10],它們在二氧化碳氣體存在下能夠與水相互溶形成均相體系。但是當體系中通入空氣或者加熱時,這類親水性試劑會轉(zhuǎn)換成疏水性試劑,實現(xiàn)兩相分離。這是由于在CO2存在的情況下,可變親水性試劑會在水中與CO2反應生成碳酸氫鹽,形成與水相互溶的均相體系。當加熱或者通入空氣等其他氣體的時候,CO2容易被置換溢出,可變親水性試劑重新轉(zhuǎn)變成疏水性試劑,使均相體系又轉(zhuǎn)變?yōu)閮上囿w系,實現(xiàn)有機相的分離,從而完成萃取過程。該類試劑的親水性和疏水性變換可以通過調(diào)節(jié)pH值來完成,在短時間內(nèi)形成含有無數(shù)有機小液滴的乳濁液,實現(xiàn)兩相的最大接觸,提高萃取效率。目前,該萃取技術已經(jīng)被應用到多個領域[11-14]。

2′-氯地西泮屬于苯二氮卓類藥物,在20世紀60年代被首次合成出來[15],由于它的安全問題而未被允許進行臨床試驗,因此在全球范圍內(nèi)均未被批準作為藥物來使用。它具有抗焦慮、抗驚厥、鎮(zhèn)靜和肌肉松弛等作用[16,17]。近年來該藥物在網(wǎng)絡上非法銷售,并被不法分子用來實施搶劫、強奸等犯罪活動。目前,生物檢材中2′-氯地西泮的前處理方法主要有直接過濾進樣法[18]和液液提取法[19,20]等,主要的檢測方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)[18-20]和毛細管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜法(capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry, CE-MS/MS)[21]等。

本文旨在將SHS-LLME技術應用到法庭科學領域,并用鹽酸和氫氧化鈉代替CO2調(diào)節(jié)pH值,實現(xiàn)親水性和疏水性的切換,達到萃取的目的。最終建立SHS-LLME聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS),分析尿液中的2′-氯地西泮,并對該方法進行評價。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1儀器

Trace 1310-ISQ LT氣相色譜質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技); TDL-80-2B離心機(上海安亭科學儀器廠); SK-1快速混勻器(金壇市順華儀器有限公司);氮吹儀(上海安普科學儀器有限公司)。

1.1.2試劑

二丙胺、三乙胺、N,N-二甲基環(huán)己胺、無水乙醇(均為色譜純,百靈威公司);鹽酸、氫氧化鈉(均為分析純,上?；瘜W試劑有限公司); 2′-氯地西泮(純度98.4% ,挪威Chiron公司);蒸餾水。

1.1.3儀器條件

色譜柱:VF-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 mm);柱溫:120 ℃,保持1 min, 20 ℃/min 升至280 ℃,保持4 min;載氣:He;流速:1.0 mL/min;進樣口溫度:280 ℃;進樣量:1 μL,不分流進樣。離子源溫度:300 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;離子源:EI; EI電壓:70 eV;掃描范圍:45～450 amu;溶劑延遲:4 min;全掃描模式(full scan)采集總離子流色譜圖。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品制備

空白尿液由近期未服用任何藥物的健康自愿者提供,在-18 ℃的冰箱中保存,使用前在室溫下解凍。

1.2.2均相親水性試劑的制備

分別將DPA、TEA、DMCHA與6 mol/L HCl按照體積比1∶1.4配制成均相的親水性試劑,每份均相親水性試劑配制50 mL,備用。

1.2.3SHS-LLME微萃取過程

取2.0 mL待測樣品于5 mL玻璃試管中,首先加入1.2.2節(jié)中配制的均相親水性試劑,與待測樣品混勻,形成均相體系;然后加入6 mol/L 的NaOH溶液,親水性試劑迅速轉(zhuǎn)變成疏水性試劑,產(chǎn)生無數(shù)有機小液滴,使整個體系快速形成乳濁液,實現(xiàn)兩相分離,完成萃取過程。以3 000 r/min 的速度離心5 min,提取上層有機相,在氮氣流下吹干,用50 μL無水乙醇復溶,待測。萃取流程詳見圖1。

圖 1 SHS-LLME萃取流程圖Fig. 1 Procedure of the switchable hydrophilictiy solvent homogeneous liquid-liquid microextraction (SHS-LLME) DMCHA: N,N-dimethylcyclohexylamine.

2 結(jié)果與討論

在SHS-LLME微萃取過程中,有許多參數(shù)影響著萃取效率。本文主要對HCl的用量、SHS的種類、均相SHS的用量、NaOH的用量、萃取時間等參數(shù)進行考察,并對所建立的實驗方法進行方法學評價。

2.1 實驗參數(shù)考察

2.1.1HCl的用量

多數(shù)文獻[22-25]報道是通過加入干冰的形式獲得均相親水性試劑。由于干冰不易保存,在配制過程中存在一定困難。因此,本文中使用HCl替代干冰制備均相親水性試劑。按照SHS與HCl(6 mol/L)體積比分別為1∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5配制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當SHS與HCl的體積比為1∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3時,SHS仍然存在分層現(xiàn)象,不能形成均相體系;當體積比達到1∶1.4和1∶1.5時,SHS與HCl互溶,形成均相體系?？紤]到如加入較多的HCl,在后續(xù)的實驗中就需要加入較多的NaOH進行中和。因此,按照SHS與HCl體積比1∶1.4配制均相親水性試劑。

2.1.2SHS的種類

親水性試劑需要滿足以下兩個條件才具備可切換的性質(zhì):第一,正辛醇/水分配系數(shù)(logKow)大約在1.2到2.5之間;第二,酸度系數(shù)pKa大于9.5。根據(jù)資料,顯示DPA的logKow=1.64, pKa=11.05; TEA的logKow=1.47, pKa=10.68; DMCHA的logKow=2.04, pKa=10.48; 3種試劑均具備可切換親水性試劑的性質(zhì)[10]。因此,本實驗選取這3種親水性試劑作為考察對象,進行優(yōu)化選擇。

根據(jù)單一變量的考察模式,在其他實驗條件固定不變的情況下,空白添加樣品中分別加入300 μL 1.2.2節(jié)中配制的DPA、TEA、DMCHA均相親水性試劑,按照1.2.3節(jié)操作,比較2′-氯地西泮的峰面積,選擇最佳SHS種類。結(jié)果發(fā)現(xiàn),加入TEA的樣品中,隨著pH值的改變,并未產(chǎn)生有機相的分離現(xiàn)象,無法滿足實驗需要。比較DPA和DMCHA的萃取效果,發(fā)現(xiàn)以DMCHA為萃取劑進行分析的樣品獲得的萃取效果最好,峰面積最大。因此,選擇DMCHA為最佳親水性試劑。

2.1.3均相DMCHA的用量

在SHS-LLME萃取過程中,均相DMCHA的用量直接影響著萃取效率。為了獲得最佳的均相DMCHA用量,在其他實驗條件不變的情況下,分別考察了100、200、300、400、500 μL的用量,實驗結(jié)果見圖2。隨著均相DMCHA用量的增加,2′-氯地西泮的峰面積也隨之增加;當用量達到400 μL時,峰面積基本達到最大;隨著用量繼續(xù)增加到500 μL,峰面積基本保持在一個平衡的狀態(tài)。因此本實驗選取均相DMCHA的最佳用量為400 μL。

圖 2 均相DMCHA的體積對萃取效率的影響Fig. 2 Efficiency of the volume of homogeneous N,N-dimethylcyclohexylamine (DMCHA)

2.1.4NaOH的用量

在SHS-LLME萃取過程中,NaOH的主要作用是中和HCl、調(diào)節(jié)pH值。加入NaOH能使親水性DMCHA轉(zhuǎn)換成疏水性DMCHA,實現(xiàn)兩相分離,完成萃取過程。因此NaOH的用量直接影響萃取效率。

在其他實驗條件不變的情況下,分別加入200、300、400、500 μL的NaOH(6 mol/L),考察NaOH的最佳用量。實驗結(jié)果表明:隨著加入NaOH體積的增加,2′-氯地西泮的峰面積也增大;當體積增大至300 μL以后,2′-氯地西泮的峰面積基本保持平衡。因此,選擇300 μL作為NaOH的最佳用量。

2.1.5萃取時間

在SHS-LLME萃取過程中,萃取時間被定義為從加入NaOH到離心前的時間間隔。在其他實驗條件不變的情況下,分別考察了不同萃取時間(1、2、3、4、5、10 min)對萃取效率的影響。結(jié)果表明,在不同萃取時間下,2′-氯地西泮的峰面積基本保持在一個平衡狀態(tài)。這表明,SHS-LLME萃取過程短時間內(nèi)就迅速達到了平衡。這是由于均相的DMCHA與樣品混溶,當加入NaOH時,HCl被迅速中和,與此同時,親水性的DMCHA快速轉(zhuǎn)換為疏水性的DMCHA,形成無數(shù)有機小液滴,使整個樣品溶液變成乳濁液,從而實現(xiàn)有機相與水相充分接觸,2′-氯地西泮能夠在短時間內(nèi)由樣品中轉(zhuǎn)移到DMCHA中,快速完成萃取過程。所以,在SHS-LLME萃取過程中,萃取時間對萃取效率基本沒有影響,因此,本實驗選擇的萃取時間為不少于1 min。

2.2 方法學評價

在最佳實驗條件下,空白尿液和空白加標尿液的總離子流色譜圖見圖3, 2′-氯地西泮的保留時間為10.34 min,定性離子為m/z283、318、290、255,定量離子為m/z283。

2.2.1工作曲線與檢出限

以空白尿液為基體,分別配制2′-氯地西泮質(zhì)量濃度為0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5 mg/L 的系列工作液,按照優(yōu)化的實驗條件進行檢測,每個樣品平行測定2次,取平均值。以2′-氯地西泮的峰面積(y)為縱坐標,質(zhì)量濃度(x, mg/L)為橫坐標繪制工作曲線。線性回歸方程為y=1.86×108x-1.18×106,相關系數(shù)r2=0.994 6,線性范圍為0.025～2.5 mg/L。通過3倍信噪比(S/N)得出檢出限為0.007 mg/L。

2.2.2精密度與回收率

取空白尿液,分別配成0.05、0.25、1.0 mg/L 3個水平的工作液,用于計算日內(nèi)回收率和日間回收率。結(jié)果見表1,回收率為76.5% ～90.3% ,日間精密度為3.6% ～5.0% ,日內(nèi)精密度為3.3% ～6.5% 。

圖 3 空白尿液和空白加標尿液(0.25 mg/L 2′-氯地西泮)的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion chromatograms of blank urine, and spiked blank urine (0.25 mg/L diclazepam)

2.3 實際樣品檢測

采用本實驗所建立的方法,對疑似被迷奸的受害人尿液進行分析。結(jié)果,在受害人的尿液中檢出2′-氯地西泮,同時還檢出地洛西泮和勞拉西泮?？傠x子流色譜圖和質(zhì)譜圖見圖4。

圖 4 尿液中勞拉西泮、2′-氯地西泮和地洛西泮的總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 4 Total ion chromatogram and mass spectra of lorazepam, diclazepam, and delorazepam in urine

由于2′-氯地西泮的含量低于本實驗方法的定量限,因此無法計算含量。根據(jù)Moosmann等[16]的研究,2′-氯地西泮在體內(nèi)首先代謝為地洛西泮和洛甲西泮,然后進一步代謝為勞拉西泮。由此可見,本實驗方法既能檢測尿液中的2′-氯地西泮,還能檢測2′-氯地西泮的代謝產(chǎn)物,能夠滿足實際案件的檢驗需要。

2.4 與文獻方法對比

將實驗結(jié)果與文獻方法進行對比(見表2),本方法選用GC-MS進行分析,靈敏、準確,回收率、線性范圍、靈敏度均能滿足實際檢驗需求。

3 結(jié)論

本工作采用SHS-LLME結(jié)合GC-MS法分析尿液中的2′-氯地西泮。以DMCHA為可切換親水性試劑,使用HCl和NaOH代替CO2實現(xiàn)DMCHA由親水性到疏水性的轉(zhuǎn)換,完成萃取過程。該方法操作簡單、快捷、線性范圍良好,回收率和精密度均能滿足檢驗需求,能夠運用于實際案件中2′-氯地西泮的分析檢驗,為該萃取技術在法庭科學領域的應用提供參考。