張夢婷, 鞏丹丹, 孫萬陽, 孫國祥*

(1. 沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 沈陽 110016; 2. 暨南大學(xué)中藥和天然藥物研究所, 廣東 廣州 510632)

薄層色譜(thin layer chromatography, TLC)技術(shù)具有簡便、經(jīng)濟、快速、定性和半定量檢測物質(zhì)的特性[1],常用于天然產(chǎn)物、食品、醫(yī)藥和微生物[2-9]等領(lǐng)域的快速分離,或作為一種樣品的前處理手段與其他分析技術(shù)進行聯(lián)用[10-16]。但目前普通TLC在高極性樣品展開過程中效率低,易拖尾,其圓狀點樣在展開后往往出現(xiàn)拖尾,變成橢徑向,甚至形成線狀,影響分離鑒定的準(zhǔn)確性;并且空間利用不足,大量消耗填充劑和展開劑。以此為出發(fā)點,為改進薄層分離技術(shù),提高分離鑒定的準(zhǔn)確性,節(jié)約資源,保護環(huán)境,本文提出以徑向展開薄層色譜法彌補普通TLC的不足。

徑向展開薄層色譜(radial thin layer chromatography, RTLC)法,也稱環(huán)形展開,簡稱徑向展開,是將樣品以實心徑向或者環(huán)形點樣在薄層板上,流動相從中心向外環(huán)形展開,根據(jù)色譜的分配和吸附原理對樣品中復(fù)雜成分進行分離的一種色譜手段[17]。這一方法在20世紀50年代即有報道[18],其展開時間短,能節(jié)約薄層板;展開劑用量少,較普通TLC精密度高,在相同條件下,RTLC較普通TLC的分辨率好[19],可用于分離分析生物樣品和異構(gòu)體[20,21]。20世紀80年代,瑞士CAMAG公司研制了徑向展開的專用設(shè)備[22],國內(nèi)也有學(xué)者對這一方法進行過探究,但是這些探究都只是從表面觀察RTLC的高效分離行為,沒有采用更精確的數(shù)學(xué)和測量手段對其分離效能進行量化評價,更沒有探究其分離特性的理論根源[23,24]。

為了更好地討論RTLC的分離效能,在試驗過程中選取氯化兩面針堿(NC)作為對照品,進行RTLC二次展開試驗。NC是由蕓香科花椒屬植物兩面針的干燥根中提取的一種生物堿[25], NC的極性很強,在普通TLC中比移值(Rf)小,很難展開,往往需要采用大極性的展開劑才能展開,而且常出現(xiàn)嚴重的斑點擴散、拖尾、斑點位置漂移等問題,嚴重時甚至造成填充劑脫板。

朱砂安神丸(ZSASP)是中藥復(fù)方重鎮(zhèn)安神制劑,由朱砂、地黃、黃連、當(dāng)歸、甘草這5種單方藥材組成[26]。在365 nm下,其中黃連中的小檗堿、巴馬汀顯黃色熒光,藥根堿顯棕褐色暗斑;在254 nm下,有兩個黃綠色熒光斑點,為巴馬汀和藥根堿[27,28]。當(dāng)歸在365 nm下有藍色熒光,在254 nm下有湖藍色熒光,均為阿魏酸(自然光下需用硫酸香草醛顯色)[29,30]。因ZSASP中黃連生物堿成分含量高,酸堿和氧化等條件會使紫外與熒光減弱或淬滅,應(yīng)當(dāng)避免使用顯色劑,所以在本實驗設(shè)計過程中只討論紫外下顯色觀察情況。

本文組裝了簡單的徑向展開薄層色譜裝置,建立了ZSASP的徑向展開薄層色譜檢測法,對其中的生物堿成分進行分離,研究了RTLC的分離特性。對RTLC和普通TLC的分離效能進行了比對研究,設(shè)計試驗進行計算和求解。

1 實驗部分

1.1 儀器

ZF-C型三用紫外分析儀(上?？岛坦怆妰x器有限公司);超聲波清洗機(廣州市吉普超聲波電子設(shè)備有限公司); ISO 9001電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 材料

ZSASP(批號:16051010,吉林市鹿王制藥股份有限公司);鹽酸小檗堿原料藥(CBH)、鹽酸小檗堿(BH)化學(xué)對照品、鹽酸藥根堿(JH)化學(xué)對照品和鹽酸巴馬汀(PH)化學(xué)對照品均為供含量測定用,均購自中國藥品生物制品檢定所;NC化學(xué)對照品(純度98% )購自上海融禾科技發(fā)展有限公司;GF254型硅膠(3色分開)購自青島海立信精細硅膠化工有限公司;羧甲基纖維素鈉、正丁醇、乙酸乙酯均為分析純,均購自天津市富宇精細化工有限公司;氨水(分析純,質(zhì)量分數(shù)25% )和冰乙酸(分析純)購自天津恒興化學(xué)試劑股份有限公司。

1.3 溶液配制

ZSASP提取物:取1/2丸ZSASP,剪碎,加入30 mL 95%(體積分數(shù),下同)乙醇,超聲30 min,過濾;向過濾后的濾渣中加入20 mL 95%乙醇,超聲20 min,過濾;合并濾液,蒸干,用甲醇溶解至5 mL。

稱取適量的CBH、BH對照品、JH對照品、PH對照品和NC對照品,分別用甲醇配制成1.5 g/L 的溶液。

1.4 展開溶劑系統(tǒng)

用溶劑系統(tǒng)A(正丁醇-乙酸乙酯-冰醋酸-水,7∶1∶1∶1, v/v/v/v)來分離BH對照品、JH對照品、PH對照品、NC對照品和ZSASP提取物;用溶劑系統(tǒng)B(正丁醇-乙酸乙酯-氨水,7∶1∶1, v/v/v)來分離CBH。

1.5 RTLC裝置

使用針頭、橡膠塞、玻璃管等組裝簡單的RTLC裝置。將2.5 mL注射器(直徑1.0 cm)塑料外管剪開,并將切口打磨光滑,將其分為若干等份,用小刀將分界處切去1～2 mm,制成分區(qū)點樣器(見圖1a)。在展開過程中,在中心處安裝一個帶孔的蓋子,可以幫助減少環(huán)境因素的影響。具體的測試條件可以根據(jù)實際測試靈活變動。圖1b是RTLC的示意圖。試驗過程中用環(huán)狀工具點出A處所指的環(huán)形斑點,或者用毛細管點出徑向斑點,用輸送工具從圓心O處向固定相上輸送展開劑,展開劑沿B處箭頭所示各個方向由中心向外展開,洗脫分離組分。

圖 1 徑向展開薄層色譜(a)裝置和(b)展開方式示意圖Fig. 1 Schematic diagram of (a) the device and (b) the development method for radial thin layer chromatography (RTLC)

2 結(jié)果與討論

在研究平面色譜問題時,可以假想將平面的薄層板卷成一個圓柱體,那么關(guān)于薄層色譜的許多問題便可以借用柱色譜的理論加以解釋和分析[25,26]。

2.1 實驗結(jié)果和現(xiàn)象

2.1.1實驗條件優(yōu)化結(jié)果和ZSASP的RTLC展開

優(yōu)化了溶劑系統(tǒng)和比例、流速等試驗條件。展開劑流速的優(yōu)化結(jié)果表明,輸送展開劑的針頭越細,展開劑流速越慢,RTLC的分離效果越好。此外,降低點樣量也對提高分離效率具有重要的現(xiàn)實意義。

ZSASP提取物經(jīng)RTLC分離出了3個成分,如圖2a所示,通過查閱參考文獻[26-29]和使用對照品進行對照,這3個成分從內(nèi)到外依次是JH、PH和BH。在該試驗中,采用玻璃圓皿制板,展開過程中消耗展開劑1.5 mL,溶劑前沿直徑為3.8 cm,點樣圈內(nèi)徑為1.0 cm,相當(dāng)于在1.4 cm的距離下展開了3個成分,具有普通TLC難以達到的極高分離效率。同時,填充劑和展開劑的用量較普通TLC大大減少,不但節(jié)省了時間和經(jīng)費,對實驗人員和環(huán)境的保護也有一定意義。

圖 2 朱砂安神丸提取物的(a)RTLC和(b)分區(qū) 點樣RTLC薄層色譜圖Fig. 2 Thin-layer chromatograms of Zhusha AnShen Pills (ZSASP) extracts with (a) RTLC and (b) RTLC with sectionalized spot The three circles are jateorhizine hydrochloride (JH), pamatine hydrochloride (PH) and berberine hydrochloride (BH) from inside to outside, respectively.

2.1.2分區(qū)點樣展開效果探索

在RTLC的實際應(yīng)用過程中,單圈徑向點樣很難應(yīng)用,而采用分區(qū)點樣方式,配合以徑向標(biāo)尺觀察,則可以提高RTLC的可行性和實用性。本文用自制分區(qū)點樣器點樣,以諾和力針頭(直徑0.23 mm)控制展開流速,以溶劑系統(tǒng)A為展開劑,以徑向玻璃皿為載體進行試驗。五分區(qū)試驗結(jié)果見圖2b。點樣被分成了5個部分,樣品在經(jīng)過RTLC后依然均勻分布,沒有發(fā)生明顯的變形,分離和展開效果良好。樣品的橫向長度隨著展開距離的增加不斷變長。結(jié)果表明,RTLC具有同時分離多個樣本的潛能。

2.2 分離效能分析

2.2.1比移值

假設(shè)薄層板吸附劑的空隙率為α,比表面積為β(β=填充劑總表面積/填充劑總體積),薄層板厚度為h。在分配色譜中,比移值Rf為任意時刻組分濃度最大點所跨過的固定相顆?？障吨g的體積Vs(此時斑點移行距離為Ls)與同一時刻流動相前沿所跨過的空間體積(即流動相體積)Vm(此時展開劑移行距離為Lm)之間的比值[31]。在吸附色譜中,用固定相的表面積(即吸附劑的表面積)Sa替代Vs來完成這一表達。保留時間和吸附平衡常數(shù)間用式(1)表達,t0為死時間,tR為組分保留時間,k為保留因子[31]。Ka為吸附色譜的吸附平衡常數(shù),也叫吸附系數(shù),其數(shù)值大小僅與吸附劑的活性、組分的性質(zhì)和流動相的性質(zhì)有關(guān),即在相同色譜條件下,其數(shù)值為定值[31]。

在TLC中,假設(shè)薄層色譜展開后對組分起作用的板寬為A,則普通TLC的比移值RfL見式(2)。在RTLC中,點樣為實心圓點(忽略其半徑),樣品展開半徑為r1,溶劑前沿半徑為r2, RTLC的k表達式為式(3), RTLC的比移值Rfr表達式為式(4)。吸附劑顆粒半徑越小,比表面積越大,其保留因子就越大,分離吸附能力也相應(yīng)提高。分配系數(shù)與展開距離比的二次方成正比關(guān)系。由式(4)可知,在使用同一吸附劑且制板技術(shù)穩(wěn)定的情況下,(1-α)β/α可以近似視為恒定值。假設(shè)在相同分離條件下,對于同一物質(zhì)的分離,當(dāng)RTLC和普通TLC達到等比移值時,可得式(5)。定義斑點移動距離和流動相移動距離之比為展開位移比dr,則普通TLC中的展開位移比drL為式(6), RTLC中的展開位移比drr為式(7)。在展開位移比相同的情況下,可推導(dǎo)出RfL和Rfr存在式(8)中的關(guān)系。以Rf為縱坐標(biāo),以dr為橫坐標(biāo),二者的關(guān)系圖見圖3。

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

drL=Ls/Lm

(6)

drr=r1/r2

(7)

(8)

按照一般薄層分離要求,認為當(dāng)Rf在0.3～0.5之間時可以取得較好的分離效果,在0.2～0.8之間時可以取得可接受的分離效果[31]。在圖3中,當(dāng)RfL在0.3～0.5之間時,drr在a到b之間,drL在c到d之間。因此在達到相同比移值時,RTLC擁有更低的展開位移比。在展開位移比相同時,RTLC有較大的比移值,故RTLC在較小的移動范圍內(nèi)就可以達到較好的比移值,可以讓在普通TLC中比移值較小的、比較難以展開的生物堿類樣品的展開斑點落在適宜的觀測范圍內(nèi),即RTLC更適用于展開大極性的樣品。

2.2.2RTLC斑點寬度和面積變化規(guī)律

在實際實驗中,由于RTLC隨著固定相表面積的梯度增加會導(dǎo)致毛細力產(chǎn)生梯度增大趨勢,這一趨勢會彌補樣品斑點的縱向擴散,不會導(dǎo)致樣品斑點的充分展寬。結(jié)合RTLC的特點,對其斑點寬度和面積變化規(guī)律討論如下。

狀態(tài)一:如圖4a所示,點樣斑點半徑為r,點在圓心處作徑向離心展開。當(dāng)流動相前沿恰好走到斑點外半徑ro位置時,如圖4b所示,徑向斑點恰好被壓縮為圓環(huán)狀,其內(nèi)半徑為斑點內(nèi)半徑ri,則有式(9)所示的關(guān)系,在吸附色譜中Sa等同于分配色譜中的Vs,將式(10)和式(11)代入式(9)中得式(12)。由式(12)得式(13),整個樣品圓環(huán)斑點總面積S0為式(14)。

Vm=(1+k)Vs

(9)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

圖 4 (a)點樣時、(b)流動相前沿到點樣斑點外半徑ro時及(c)流動相前沿到任意位置LM時的RTLC示意圖Fig. 4 Schematic diagrams of RTLC (a) when spotting, (b) when the developer reached outside radius of the spot at ro and (c) when the developer arrived at any position (LM) r is the radius of sample spot; ri is the inside spot radius when mobile phase front arrives at the outside spot radius at ro; Li is the inside radius of the spot when solvent arrived at any position LM; Lo is the outside radius of the spot when solvent arrives at any position LM.

狀態(tài)二:如圖4c所示,當(dāng)流動相前沿走到任意位置LM時,若僅考慮壓縮效應(yīng),不考慮其他因素引起的斑點增寬,用Li和Lo分別表示新圓環(huán)的內(nèi)外半徑,則有式(15～17)。由式(17)可得式(18)。

(15)

(16)

(17)

(18)

從狀態(tài)一到狀態(tài)二,原來位于ro處的樣品剛好走到Lo處,位于ri處的流動相此時已經(jīng)走到了LM處,根據(jù)式(9)中的規(guī)律可以得到式(19),由式(19)可得式(20),新的圓環(huán)斑點總面積S1為式(21)。

(19)

(20)

(21)

式(21)與式(14)結(jié)果一樣,這表明在RTLC中,盡管斑點形狀一直在不斷徑向前行變化,但圓環(huán)斑點總面積是恒定的。

定義圓環(huán)斑點寬度W為斑點在展開方向上的展開距離最大點與展開距離最小點之間的差值[31],則在RTLC中,圓環(huán)斑點寬度是圓環(huán)斑點的外半徑和內(nèi)半徑之差。設(shè)圓環(huán)斑點在某一位置時斑點內(nèi)半徑為ri1,外半徑為ro1,內(nèi)外半徑的均值為ra1,ra1同時是此時斑點的移動距離。圓環(huán)斑點寬度為W1,圓環(huán)斑點面積為Sx,持續(xù)展開至另一位置時,圓環(huán)斑點內(nèi)半徑為ri2,外半徑為ro2,內(nèi)外半徑的均值為ra2,ra2同時是此時圓環(huán)斑點的移動距離,圓環(huán)斑點寬度為W2,則有:

(22)

在RTLC中,當(dāng)展開達到動態(tài)平衡時,環(huán)面積不變,圓環(huán)斑點寬度Wr與環(huán)半徑r成反比,隨展開距離的增大,Wr將不斷地減小,同時斑點的橫向長度不斷增大。即假設(shè)樣品點樣在距圓心5 mm處,展開后樣品距圓心30 mm,則由上述關(guān)系可知,圓環(huán)斑點的橫向長度會擴大為原來的6倍,而圓環(huán)斑點寬度則壓縮為原來的1/6,這與RTLC所提供的色譜空間不斷增大有關(guān),可以有效降低拖尾現(xiàn)象,增大分離度(R),使圓環(huán)斑點清晰明顯,可以在極短展開距離內(nèi)實現(xiàn)盡可能多的化學(xué)成分的分離。

2.2.3分離度

分離度是平面色譜的重要分離參數(shù),是相鄰兩斑點中心距離d與兩斑點平均寬度的比值。用W1和W2表示相鄰兩斑點寬度,L1和L2表示相鄰兩斑點的移動距離,參考文獻[32]有:

(23)

在普通TLC中,忽略斑點的擴散和拖尾,可假設(shè)斑點寬度一致,均為WL,相鄰兩斑點距離為dL,則其分離度RL為:

(24)

在RTLC中,用ra1和ra2表示相鄰兩個圓環(huán)斑點的移動距離,相鄰兩圓環(huán)斑點寬度為Wr1和Wr2,圓環(huán)斑點距離為dn,由式(22)和式(23)可以推知其分離度Rr為式(25):

(25)

對比可知,當(dāng)dn等于dL,且Wr1與WL相同時,RTLC的分離度比普通TLC要大。

2.2.4理論塔板數(shù)

色譜系統(tǒng)的分離效能常用理論塔板數(shù)(N)或理論塔板高度來定量描述。在薄層色譜中,可按式(26)計算[33],X是圓環(huán)斑點移動距離,Wn是圓環(huán)斑點寬度。普通TLC的理論塔板數(shù)可以直接用式(26)表示。在RTLC中,以rx表示圓環(huán)斑點移動距離,Wx表示此時的圓環(huán)斑點寬度,S0表示圓環(huán)斑點點樣面積,由式(22)和式(26)可以得到RTLC的理論塔板數(shù)Nr,見式(27)。

(26)

(27)

在普通TLC中,理論塔板數(shù)和圓環(huán)斑點的移動距離平方成正比關(guān)系,與圓環(huán)斑點寬度平方成反比;而RTLC中,理論塔板數(shù)與圓環(huán)斑點移動距離的4次方成正比,與圓環(huán)斑點面積平方成反比。改進技術(shù)、減少點樣量和控制點樣時斑點面積的前提下,隨著斑點展開距離的增大,RTLC的理論塔板數(shù)比普通TLC要高很多。

2.3 試驗設(shè)計驗證與數(shù)據(jù)擬合分析

為了驗證上述理論過程,設(shè)計了CBH、ZSASP、NC的普通TLC和RTLC試驗,采集了相關(guān)參數(shù)。結(jié)果表明,在CBH的普通TLC試驗中,只得到了一個大的斑點,并且伴有嚴重拖尾和擴散,在CBH的RTLC中,得到了2個斑點,經(jīng)過HPLC檢測,推測這兩個斑點是BH及CBH中的相關(guān)雜質(zhì)成分。在ZSASP的普通TLC和RTLC中都成功地對其中的3個生物堿成分進行了分離,斑點從內(nèi)到外依次為JH、PH和BH。

表 1 RTLC和普通TLC Rf值的t-檢驗

CBH: crude berberine hydrochloride.

表 2 RTLC和普通TLC分離度t-檢驗

控制截距為0,以普通TLC的分離度為橫坐標(biāo)(x2),以RTLC的分離度為縱坐標(biāo)(y2)進行數(shù)據(jù)擬合。其擬合方程為y2=1.55x2,R2=0.922 5。對試驗中采集的ZSASP的RTLC和普通TLC數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析表明,RTLC的分離度和普通TLC的分離度之間存在顯著性差異,且RTLC的分離度比普通TLC高,見表2。

為了驗證2.2.2節(jié)中關(guān)于面積和圓環(huán)斑點寬度的推導(dǎo)過程,設(shè)計了NC對照品的RTLC二次展開試驗進行驗證。這一部分試驗數(shù)據(jù)采集的最理想手段應(yīng)該是采用計算機圖片識別方法來獲取目標(biāo)數(shù)據(jù),但是由于技術(shù)手段的限制,采取了直接手動測量展開圓斑內(nèi)徑和外徑的方式來計算內(nèi)徑和外徑的移動情況、圓環(huán)斑點的寬度和面積的變化情況。并就此對第1次和第2次RTLC的圓環(huán)斑點寬度和面積進行了數(shù)據(jù)擬合和顯著性檢驗(見表3)。同樣控制截距為0,以第1次RTLC的圓環(huán)斑點面積(x3,單位cm2)為橫坐標(biāo),以第2次RTLC的圓環(huán)斑點面積(y3,單位cm2)為縱坐標(biāo),擬合得到y(tǒng)3=0.95x3,R2=0.962 9。顯著性檢驗表明,第1次和第2次RTLC的圓環(huán)斑點寬度存在顯著差異,并且圓環(huán)斑點寬度隨著展開距離的增加而被壓縮了。而兩次展開的圓環(huán)斑點面積并不存在顯著差異,也就是說當(dāng)分離達到平衡后,斑點的面積是不發(fā)生改變的。展開試驗的結(jié)果為理論計算的結(jié)論提供了有利支持。

表 3 不同展開時間點RTLC斑點面積和寬度t-檢驗

3 結(jié)論

RTLC隨著固定相表面積的梯度增加會導(dǎo)致毛細力產(chǎn)生梯度增大趨勢,使得斑點的縱向擴張能力增強,在展開方向上的壓縮增強,很少出現(xiàn)拖尾,使RTLC比普通TLC試驗的清晰度和準(zhǔn)確度更高。相同樣品在相同固定相和流動相下,RTLC的分離度比普通TLC大,擁有更高的分離效率。RTLC的比移值比普通TLC大,更適用于大極性樣品的分離鑒定。載體用量省,展開劑用量小,可以節(jié)約試劑成本,并降低對試驗人和環(huán)境的傷害。目前,RTLC的多樣本分離已經(jīng)取得了很好的效果,但是多樣本同時定性尚未取得重大突破。在分區(qū)點樣展開的可行性的啟發(fā)下,多樣本同時定性技術(shù)的進一步突破也將極大地擴展RTLC的應(yīng)用范圍,值得進一步探索。在理論推導(dǎo)和試驗驗證中,存在諸多的假設(shè)和取舍,可為理論創(chuàng)新提供新的方法和思路。隨著點樣和定量等輔助技術(shù)的進一步發(fā)展,徑向薄層色譜技術(shù)將在平面色譜快速分離和樣品預(yù)處理的應(yīng)用方面大放異彩。