張曉藝, 張秀堯, 蔡欣欣, 李瑞芬

(溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001)

氟乙酸鈉和氟乙酰胺均為有機氟類殺鼠劑,大鼠口服的半數(shù)致死劑量為0.22 mg/kg,人口服半數(shù)致死量為0.1～10 mg/kg,屬A級有機劇毒物質(zhì)。氟乙酸鈉和氟乙酰胺進入機體內(nèi)均會被代謝生成氟乙酸(MFA),其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。氟乙酸可使三羧酸循環(huán)中斷,引起生理和生化功能障礙,甚至可以造成神經(jīng)系統(tǒng)損害而引起死亡。氟乙酸鈉和氟乙酰胺的毒性強,起效快,致死率高,容易引起二次中毒,我國于1982年就明令禁止其生產(chǎn)、銷售和使用。但新西蘭、美國和以色列等國仍允許使用[1,2]。據(jù)報道[3，4]某些天然植物也含有氟乙酸類物質(zhì),曾引起家畜中毒事件。

圖 1 氟乙酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of monofluoroacetic acid

氟乙酸為水溶性極性化合物,直接分析測定難度大,往往需要進行衍生化反應(yīng)改變其化學(xué)性質(zhì),常用的分析方法有氣相色譜法[5,6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7-9]、液相色譜熒光法[10-12]、液相色譜-質(zhì)譜法[13],但均操作繁瑣。有報道[14,15]采用離子色譜法直接測定血液中氟乙酸,但靈敏度較低,易受基體成分干擾而出現(xiàn)假陽性結(jié)果;陳學(xué)國等[16]采用反相色譜-質(zhì)譜法直接測定血中氟乙酸,但氟乙酸在色譜柱的死時間附近出峰,基質(zhì)干擾嚴(yán)重,方法靈敏度低;Xu等[17]利用親水相互作用色譜(HILIC)-質(zhì)譜法直接測定尿液中的氟乙酸,但方法易受樣品基質(zhì)影響,保留時間不穩(wěn)定[18],靈敏度不高;Hamelina等[19]使用反相和陰離子交換混合機理的色譜柱(Primesep B2)進行分離,三重四極桿質(zhì)譜法直接測定尿液中的氟乙酸。

近年來,離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜法(IC-MS/MS)在食品和環(huán)境中的應(yīng)用越來越廣泛[20-26],但在生物樣品中的應(yīng)用較少[27,28], Cai等[27]報道了IC-MS/MS測定血清中有毒殺鼠劑異殺鼠酮的檢測方法,以Ionpac AS11色譜柱為分離柱,以甲醇-30 mmol/L KOH (10∶90, v/v)為流動相進行分離,采用電噴霧電離源，在負(fù)離子和MRM模式下檢測,方法的定量限為0.5 ng/mL。Baygildiev等[28]建立了檢測大鼠尿液中有機磷神經(jīng)毒劑代謝產(chǎn)物甲基膦酸的IC-MS/MS方法,以實驗室合成的陰離子交換樹脂自填的色譜柱為分析柱,200 mmol/L 甲酸水溶液作為淋洗液,三重四極桿質(zhì)譜檢測,檢出限為4 ng/mL。但采用離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定血漿和尿液中氟乙酸的檢測方法鮮有文獻(xiàn)報道。本文采用高氯酸超聲提取,叔丁基甲醚萃取凈化,離子色譜分離,三重四極桿質(zhì)譜法直接測定,穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法定量。該方法靈敏、準(zhǔn)確、精密、快速。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

離子色譜系統(tǒng)由Dionex ICS-1100離子色譜儀,RFC-30淋洗液自動發(fā)生器、ASRS 500電解再生抑制器和DV-AS自動進樣器組成,變色龍工作站(7.22版)控制(美國Thermo Scientific公司); QTRAP 6500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀,由Analyst 1.6.2軟件控制(美國AB Sciex公司); Orion 5-star酸度計(美國Orion公司); 2510超聲波清洗機(美國Branson公司); Multi Reax數(shù)顯型多管旋渦混合器(德國Heidolph公司); 3-30K高速冷凍離心機(德國Sigma公司); 24孔N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司); Gradient A10 Milli-Q超純水器(法國Millipore公司)。

叔丁基甲醚(MTBE)為色譜純(德國Merck公司);高氯酸為分析純(上海桃浦化工廠);親水聚四氟乙烯(hydrophilic PTFE)濾膜針式過濾頭(直徑：13 mm,孔徑：0.22 μm,上海安譜實驗科技股份有限公司);氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度97% ,德國Dr. Ehrenstorfer公司);13C2-氟乙酸鈉同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(新西蘭BDG Synthesis公司)。分別用水溶解并稀釋氟乙酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),配制1.00 g/L 的氟乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液和100 mg/L 的13C2-氟乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液;臨用時再用水稀釋成適合濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。血漿樣品購自溫州市中心血站,尿液樣品由身體健康的志愿者提供。

1.2 樣品前處理

吸取血漿試樣1.00 mL,置于5 mL Eppendroff管中,加入100 μL 1.0 mg/L13C2-氟乙酸同位素內(nèi)標(biāo)使用液,加入2.0 mL 3%(v/v)高氯酸水溶液,旋渦10 s,超聲提取5 min,于6 ℃以 10 000 r/min 離心5 min,取上清液(pH 0.5～1.0)置于15 mL具塞離心管中。

吸取尿液試樣1.00 mL,置于15 mL具塞離心管中,加入100 μL 1.0 mg/L 的同位素內(nèi)標(biāo)使用液,加入2.0 mL 3%(v/v)高氯酸水溶液,旋渦混合10 s。

向血漿提取液或尿液提取液中加入4.0 mL叔丁基甲醚,置于多管旋渦混合器中,以最大速度旋渦3 min,以 10 000 r/min 離心3 min,移取上清液,下層水相用4.0 mL叔丁基甲醚重復(fù)萃取1次,合并2次萃取液,加入100 μL 1%(v/v)氨水丙酮溶液,混勻,于45 ℃氮氣吹至近干,加入1.0 mL 0.1%(v/v)氨水溶液,旋渦溶解,過0.22 μm濾膜,待測。

1.3 分析條件

1.3.1色譜條件

分析柱為Ionpac AS 19型色譜柱(250 mm×2 mm, 7.5 μm);保護柱為AG19(50 mm×2 mm); ASRS 500陰離子抑制器(2 mm,外接水模式);氫氧化鉀淋洗液由RFC-30在線自動產(chǎn)生;梯度淋洗:0～7.0 min, 5 mmol/L KOH; 7.0～8.0 min, 5 mmol/L KOH～70 mmol/L KOH; 8.0～14.0 min, 70 mmol/L KOH; 14.0～14.1 min, 70 mmol/L KOH～5 mmol/L KOH ;14.1～20.0 min, 5 mmol/L KOH;淋洗液流速為0.30 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣體積為10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源,負(fù)離子模式;掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度(TEM)為650 ℃;離子化電壓(IS)為-4 500 V;氣簾氣(CUR)壓力為277 kPa;噴霧氣(GS1)壓力為345 kPa;輔助加熱氣(GS2)壓力為345 kPa;碰撞氣(CAD)強度為中等(medium)。氟乙酸定量離子對為m/z77.0>57.0,去簇電壓(DP)為-40 V,碰撞能量(CE)為-15 eV;13C2-氟乙酸的定量離子對為m/z79.0>59.0;去簇電壓(DP)為-40 V,碰撞能量(CE)為-15 eV。質(zhì)譜峰駐留時間均為 1 000 ms。

運行開始時,色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液,5.50 min時切換至離子源,8.00 min時六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氟乙酸在水中易形成帶負(fù)電荷的氟乙酸根離子,故采用電噴霧電離、負(fù)離子模式下對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化,第1級四極桿(Q1)掃描時出現(xiàn)[M-H]-峰,以[M-H]-作為母離子進行碰撞解離,子離子掃描發(fā)現(xiàn)有[M-H-HF]-(m/z57.0)和[M-H-COO]-(m/z33.0)碎片離子,再對去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化,使子離子的信號達(dá)到最高,優(yōu)化后的結(jié)果顯示:m/z為57.0的碎片離子信號高,而m/z為33.0的碎片離子信號較低,約為m/z57.0的1/10,且基線信號較高,實際樣品檢測時有干擾峰存在。因此實驗僅選擇m/z77.0和m/z57.0作為定量離子對。設(shè)定合適的峰駐留時間(dwell time)使色譜峰的采樣點數(shù)在15～20之間,可獲得較好的定量重復(fù)性。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見1.3.2節(jié)。

2.2 離子色譜條件優(yōu)化

氟乙酸為弱酸性水溶性化合物,特別適合用離子色譜進行分離[14,15],試驗采用高容量AS 19陰離子交換色譜柱、5 mmol/L KOH對樣品中的氟乙酸進行分離,然后再用70 mmol/L KOH進行強洗脫以去除色譜柱上強保留成分,可以消除對后續(xù)樣品分析造成的不良影響。色譜柱流出液經(jīng)陰離子抑制器抑制去除流動相中的鉀離子,然后進入質(zhì)譜系統(tǒng)進行檢測。采用0.5 mL帶濾頭的自動進樣瓶,進樣前先用1.0 mL的水清洗進樣管路,去除進樣殘留液,進樣 1 000 μg/L 氟乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后再進一針空白溶液,結(jié)果顯示無氟乙酸殘留。優(yōu)化后的離子色譜條件見1.3.1節(jié)。

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

2.3.1提取劑的選擇

氟乙酸為水溶性弱酸,酸度常數(shù)pKa為2.73[29],在pH<2的酸性條件下可被乙酸乙酯萃取[5,6]?？紤]到血漿樣品含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì),選擇3%(v/v)高氯酸水溶液作為提取劑,既能提取氟乙酸又能沉淀去除蛋白質(zhì)。結(jié)果表明,1.00 mL血漿樣品用2.0 mL 3% (v/v)高氯酸水溶液可完全沉淀去除蛋白質(zhì),超聲提取后再低溫高速離心,可得到澄清的提取液,此時提取液的pH值為0.5～1.0,氟乙酸呈分子狀態(tài),易被有機溶劑萃取,在有機萃取液中加入100 μL 1% (v/v)氨水丙酮,使氟乙酸生成氟乙酸銨鹽,以免氮吹過程損失,最終殘渣用0.1%(v/v)氨水溶解。試驗吸取1.00 mL血漿樣品,添加10 ng氟乙酸,按1.2節(jié)描述處理,測定氟乙酸的色譜峰面積,并與1.00 mL血漿樣品按1.2節(jié)描述處理再添加10 ng氟乙酸的峰面積進行比較,結(jié)果表明,高氯酸的提取率約為88% 。

2.3.2萃取劑

文獻(xiàn)[5,6]報道多采用乙酸乙酯作為氟乙酸的萃取劑,考慮到叔丁基甲醚與乙酸乙酯有相似的萃取性能,故將二者進行比較。試驗分別吸取1.00 mL血漿和尿液樣品,添加10 ng氟乙酸,分別用4.0 mL叔丁基甲醚和乙酸乙酯進行萃取和測定。結(jié)果顯示,叔丁基甲醚萃取的氟乙酸色譜峰面積比乙酸乙酯萃取液的峰面積約高20% ,因此確定叔丁基甲醚為萃取劑。

2.3.3提取液pH的選擇

將7份尿液樣品分別用高氯酸或氨水調(diào)節(jié)至pH 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和5.0,再分別加入20 ng氟乙酸,用4.0 mL叔丁基甲醚進行萃取和測定。結(jié)果顯示,在pH 0.5～1.0范圍內(nèi)氟乙酸的響應(yīng)值最高,因此將此pH范圍作為叔丁基甲醚的萃取條件。

圖 2 加標(biāo)尿液樣品中氟乙酸的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of monofluoroacetic acid spiked in plasma samples

2.3.4萃取次數(shù)的選擇

分別向pH 0.5～1.0血漿和尿液的高氯酸提取液添加10 ng氟乙酸,用4.0 mL叔丁基甲醚萃取3次,計算每次的萃取率,血漿和尿液樣品的第1次萃取率約為62% ～64% ,第2次的萃取率約為28%～30%,前2次的萃取率總和約為90% ～94% 。因此最終采用4.0 mL叔丁基甲醚萃取2次。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿和尿液樣品,按1.2節(jié)描述操作,得到空白樣品處理液,加入氟乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)制作基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中氟乙酸色譜峰面積的比值×100%進行評估,當(dāng)ME>100%為基質(zhì)增強效應(yīng),ME<100%為基質(zhì)抑制效應(yīng)[30]。結(jié)果顯示,血漿和尿液中氟乙酸的基質(zhì)效應(yīng)約為61%和30% 。本法采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法進行定量,可有效校正樣品中的基質(zhì)效應(yīng),從而得到準(zhǔn)確結(jié)果。

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

將氟乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、0.3、1.0、5.0、50.0、500和 1 000 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(各含有100 μg/L13C2-氟乙酸同位素標(biāo)準(zhǔn)溶液),按1.2節(jié)描述進行處理,采用MultiQuant定量軟件進行數(shù)據(jù)處理,以氟乙酸定量離子對與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)對相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x, μg/L)進行線性回歸(權(quán)重取1/x),回歸方程為Y=0.016 1x+0.002 5,相關(guān)系數(shù)>0.999,線性關(guān)系良好。

在空白血漿和尿液樣品中分別加入低濃度的氟乙酸進行測定,以分子離子對的信噪比≥3和10時的樣品濃度作為檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。結(jié)果表明,血漿和尿液的檢出限分別為0.03 μg/L 和0.1 μg/L,定量限為0.1 μg/L 和0.3 μg/L。方法靈敏度優(yōu)于文獻(xiàn)[16,19]報道值。在定量限水平下加標(biāo)尿液樣品的色譜圖見圖2。

2.6 加標(biāo)回收率

在空白血漿中分別添加0.1、0.5、50、800 μg/L 4個水平的氟乙酸,空白尿液中分別添加0.3、5.0、50、800 μg/L 4個水平的氟乙酸,按1.2節(jié)描述進行樣品處理,每個添加水平平行測定6次。結(jié)果表明,血漿和尿液樣品中氟乙酸的加標(biāo)回收率為96.2% ～120% ,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1% ～13.1%(見表1),符合痕量分析的要求。

3 結(jié)論

本法采用高氯酸提取、叔丁基甲醚液液萃取凈化,離子色譜-三重四極桿質(zhì)譜法直接快速測定血漿和尿液中的氟乙酸,穩(wěn)定同位素稀釋法定量。該法準(zhǔn)確、精密,操作簡單,線性范圍寬,靈敏度高,適用于血漿和尿液樣品中痕量氟乙酸的測定。