張本斯 李 莊 卞思源 楊 桂 李艷嬌 張 覃 黃 煜

(大理大學(xué), 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室, 2 附屬醫(yī)院胸外科, 大理 671000)

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是很有前途的腫瘤基因治療方法[1]。構(gòu)建靶向促凋亡基因,將具有導(dǎo)向能力的腫瘤特異性分子與促凋亡蛋白偶聯(lián),靶向促凋亡蛋白在體內(nèi)就像“死亡開關(guān)”,定向?qū)ふ夷[瘤細(xì)胞,誘導(dǎo)其自殺,同時對正常組織又不造成損傷[2]。EphA2是受體酪氨酸激酶家族(RTKs)的重要成員,其特異性配體為EphrinA1。兩者結(jié)合產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能直接參與各種生理活動,包括細(xì)胞生長、遷徙、分化及血管發(fā)生等[3]。研究表明,EphA2高表達于高侵襲性腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞,與患者預(yù)后顯著相關(guān)[4-6]。本課題組前期研究顯示EphA2高表達于乳腺癌組織,其陽性率與病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織學(xué)分級相關(guān)[7]。鑒于乳腺癌過度表達EphA2,選擇其配體EphrinA1作為靶向促凋亡蛋白的靶向分子,參與構(gòu)建靶向促凋亡基因EphrinA1-caspase-3。caspase-3作為凋亡的最終執(zhí)行因子,有望成為理想的腫瘤治療因子[8]。但胞質(zhì)中caspase-3以無活性前體(Procaspase-3)存在。Srinivasula等[9]構(gòu)建了一種重構(gòu)型caspase-3分子,無需上游caspases切割即具有活性。如何使caspase-3分子特異地進入腫瘤細(xì)胞是其發(fā)揮自殺基因作用的關(guān)鍵。本研究擬用人活性型caspase-3和EphrinA1的基因,構(gòu)建一種新型靶向促凋亡基因,即EphrinA1-caspase-3,并將該基因亞克隆入腺病毒載體,包裝獲得重組腺病毒,為后續(xù)以重組腺病毒介導(dǎo)目的基因修飾人外周血T淋巴細(xì)胞,研究T淋巴細(xì)胞表達的融合蛋白EphrinA1-caspase-3在體內(nèi)外對乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用奠定基礎(chǔ),為進一步探索利用EphrinA1/EphA2系統(tǒng)介導(dǎo)選擇性誘導(dǎo)高表達EphA2受體的腫瘤細(xì)胞死亡提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 基因、載體、細(xì)胞和主要試劑

pMD18T-casp3和pMD18T-EFNA1基因、大腸桿菌DH5α(長沙愛科博生物科技有限公司)；重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)(包括pAD/pl-DEST腺病毒骨架及穿梭載體)、HEK293細(xì)胞(Invitrogen公司)；感受態(tài)細(xì)胞TOP 10(Biontex公司)。Not I、EcoR I、Sal I、T4 DNA Ligase、Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)；METAFECTENETM轉(zhuǎn)染試劑、LR Clonase Ⅱ(Invitrogen公司)；DMEM/High Glucose培養(yǎng)基、胰酶(Hyclone公司)；胎牛血清、青霉素/鏈霉素(Gibco公司)；XbaI、Pac Ⅰ(NEB公司)。

1.2 引物的設(shè)計和合成

1.3 pET28a-Casp3載體的構(gòu)建

首先進行caspase-3基因的PCR擴增及回收,用Casp3-F和Casp3-SalNotR引物,以含有人活性型caspase-3基因的pMD18T-casp3為模板擴增目的基因。在EP管中依次加入： 10×PCR Buffer 5μl、Taq DNA polymerase 0.5μl、dNTP(10mmol/L)1μl、Casp3-F 1μl、Casp3-SalNotR 1μl、pMD18T-casp3 2μl、加ddH2O至50μl反應(yīng)體系中進行反應(yīng)。反應(yīng)條件為： 95℃變性5min；95℃ 30s→56℃ 30s→72℃ 1min,共計30個循環(huán)；72℃延伸10min,置4℃保存。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,GIS凝膠系統(tǒng)檢測是否出現(xiàn)預(yù)期的caspase-3基因帶(1kb),并用膠回收試劑盒回收目的片段。接著將caspase-3基因亞克隆至pET28a載體,對回收的caspase-3片段和pET28a載體進行Sal I和Not I雙酶切,將反應(yīng)體系(表1)放到37℃水浴中反應(yīng)30min。1%瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物。按載體與目的片段為1∶3的比例,用T4 DNA連接酶連接,連接反應(yīng)體系為： caspase-3目的片段3.0μl,pET28a 1.0μl,10×T4 Ligase buffer 2.0μl,T4 Ligase 1.0μl,ddH2O 13.0μl,總共20μl體系?；靹蚝?2℃反應(yīng)4h。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,次日挑取陽性克隆,送南京金斯瑞科技有限公司測序鑒定,正確克隆命名為pET28a-Casp3。

表1 Caspase-3目的片段和pET28a載體的雙酶切反應(yīng)體系(μl)

1.4 pET28a-EphrinA1-Casp3載體的構(gòu)建

首先進行EphrinA1基因的PCR擴增及回收,用EphrinA1-ECOSALF/EphrinA1-ECOSALR引物,以pMD18T-EphrinA1為模板擴增目的基因。在反應(yīng)體系中加EphrinA1-ECOSALF 1μl、EphrinA1-ECOSALR 1μl、pMD18T-EphrinA1 2μl,其余試劑和反應(yīng)條件與“caspase-3基因的PCR擴增”相同。將PCR產(chǎn)物電泳,檢測是否出現(xiàn)預(yù)期條帶(618bp),回收目的片段。接著將EphrinA1基因亞克隆至pET28a-Casp3載體,對EphrinA1基因片段和pET28a-Casp3載體進行Eco RI和Sal I雙酶切,將反應(yīng)體系(表2)放到37℃水浴,反應(yīng)30min。電泳、回收酶切產(chǎn)物,在連接反應(yīng)體系加EphrinA1基因片段3.0μl,pET28a-Casp3載體1.0μl,其余試劑和反應(yīng)條件與“1.3”類似。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,次日挑取陽性克隆,提取質(zhì)粒,Eco RI和Sal I雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳。并將陽性克隆送公司測序,正確克隆命名為pET28a-EphrinA1-Casp3。

表2 EphrinA1基因片段和pET28a-Casp3載體的雙酶切反應(yīng)體系(μl)

1.5 pEC3.1-EphrinA1-Casp3穿梭載體的構(gòu)建

將pET28a-EphrinA1-Casp3和穿梭質(zhì)粒pEC3.1(+)用EcoR I和Not I雙酶切,將反應(yīng)體系(與1.4類似)置于37℃水浴30min,回收酶切產(chǎn)物。在T4 DNA Ligase作用下,亞克隆EphrinA1-Casp3至穿梭載體pEC3.1(+)上(連接反應(yīng)與1.3類似),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,挑取Ampr抗性單菌落,雙酶切和測序鑒定,陽性克隆命名為pEC3.1-EphrinA1-Casp3。

1.6 pAd-EphrinA1-Casp3重組腺病毒載體的構(gòu)建

2011年10月18日，由廣東省粵電集團投資的目前世界上單機容量及總裝機容量最大的秸稈直燃發(fā)電項目正式投入商業(yè)運營。該電廠選用2×50MW凝汽式汽輪機發(fā)電機組，配2×220t/h高溫高壓循環(huán)流化床鍋爐。2015年，年利用小時數(shù)超過6700h。該秸稈直燃發(fā)電項目每年可節(jié)約約10萬噸標(biāo)準(zhǔn)煤，減少二氧化碳排放約30萬噸，減少二氧化硫排放近2000t[22]。

采用LR體外同源重組,將pEC3.1-EphinA1-Casp3載體的EphrinA1-caspase3表達框轉(zhuǎn)移至腺病毒表達載體pAd/pl-DEST(圖1)上,反應(yīng)體系為： pEC3.1-EphinA1-Casp3 (0.1μg/μl) 1.5μl,pAd/pl-DEST (0.02μg/μl) 1.5μl,LR Clonase Ⅱ 2μl,加ddH2O至10μl。25℃反應(yīng)1 h。蛋白酶K消化LR Clonase II,37℃反應(yīng)15min。將5μl反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP 10,涂布于含Ampr抗性的LB平板,37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。挑取3～4個單克隆菌落接種于10ml LB培養(yǎng)液中,37℃恒溫?fù)u床(250r/min)培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒,XbaⅠ單酶切鑒定,反應(yīng)體系為： 10×Buffer 1.5μl,XbaI 0.5μl,重組腺病毒質(zhì)粒13μl,總共15μl體系。正確質(zhì)粒命名為pAd-EphrinA1-Casp3。

1.7 重組腺病毒載體pAd-EphrinA1-Casp3的包裝

先用PacI單酶切,準(zhǔn)備線性化的pAd-EphrinA1-Casp3質(zhì)粒DNA,反應(yīng)體系為： 10×Neb Buffer 5μl, 10×BSA 5μl, Pac I(10unit/μl)1μl,重組腺病毒質(zhì)粒39μl,總共50μl體系。37℃水浴反應(yīng)5h。酚/氯仿/異戊醇抽提、純化,乙醇洗滌、沉淀,加30μl dH2O溶解,取3μl電泳鑒定。接著將線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293,依照說明書,用METAFECTENETM轉(zhuǎn)染試劑,按DNA： lipid=1∶3的比例對達到50%～70%融合度的HEK 293細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染。每天觀察細(xì)胞病態(tài)反應(yīng)(cytopathic effect, CPE)。當(dāng)有明顯CPE現(xiàn)象,且有>50%脫壁時即收集細(xì)胞,在干冰浴及37℃間反復(fù)凍融3次,裂解細(xì)胞,離心、收集上清,-74℃保存。然后取適量上清再次感染HEK293細(xì)胞,放大培養(yǎng)重組腺病毒,當(dāng)有明顯CPE現(xiàn)象時,收集病毒。最后PCR驗證重組腺病毒,取上清20μl,提取病毒DNA。設(shè)計引物EphrinA1正義序列為5′CAGTTCAAATC CCAAGTTCCG3′,反義序列為5′TGACCGATGCTA TGTAGAACCC。以病毒DNA為模板PCR擴增。反應(yīng)體系為： 10×PCR Buffer 2.5μl,rTaq 0.25μl,dNTP(2.5mmol/L)1μl,EphrinA1-F (20μmol/L) 0.5μl, EphrinA1-R (20μmol/L) 0.5μl,病毒DNA 1μl,加dH2O至25μl。反應(yīng)條件為： 95℃變性2min；95℃ 15s→55℃ 15s→72℃ 50s,共計35 cycles；72℃ 5min延伸,4℃保存。電泳檢測是否出現(xiàn)預(yù)期條帶(465bp)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-Casp3的鑒定

Caspase-3基因PCR產(chǎn)物電泳,可見大小約1000bp的清晰條帶,與預(yù)期相符(圖1),膠回收目的片段。在目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)皿中可見陽性菌落,具有抗生素抗性的陽性對照也布滿陽性菌落,而不加任何DNA的感受態(tài)細(xì)胞的陰性對照則未見陽性菌落生長,表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。將陽性克隆測序,把所得序列與人活性型caspase-3基因序列比對,完全一致,成功獲得質(zhì)粒pET28a-Casp3。

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-EphrinA1-Casp3的鑒定

EphrinA1基因PCR產(chǎn)物電泳,顯示片段大小約為618bp,與EphrinA1的理論大小一致(圖2),膠回收目的片段。提取陽性克隆質(zhì)粒進行Eco RI和Sal I雙酶切,可切出約1.6kb的片段帶和約5.0kb的載體帶,推測EphrinA1-caspase-3基因片段已被克隆到pET28a載體。測序分析(圖3)顯示pET28a-EphrinA1-Casp3包含Genebank公布的EphrinA1胞外端基因序列及caspase-3基因序列,表明pET28a-EphrinA1-Casp3構(gòu)建成功。

圖1 Caspase-3基因PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖.

圖2 EphrinA1基因PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖.

Fig 1 PCR product of caspase-3 gene was verified by 1% agarose gel electrophoresis. M： DNA marker； 1： PCR product of caspase-3 gene.

Fig 2 PCR product of EphrinA1 gene was verified by 1% agarose gel electrophoresis. M： DNA marker； 1： PCR product of EphrinA1 gene.

圖3 質(zhì)粒pET28a-EphrinA1-caspase-3的測序

2.3 重組質(zhì)粒pEC3.1-EphrinA1-Casp3的鑒定

提取陽性菌落質(zhì)粒,Eco RI和Sal I雙酶切鑒定,可切出約1.6kb的片段帶和約4.4kb的載體帶(圖4),與預(yù)期相符。測序顯示質(zhì)粒pEC3.1-EphrinA1-Casp3包含EphrinA1-caspase-3基因,提示pEC3.1-EphrinA1-caspase-3構(gòu)建成功。

2.4 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-EphrinA1-Casp3的鑒定

用XbaⅠ單酶切陽性克隆質(zhì)粒DNA,電泳顯示約3kb和大于15kb的條帶(圖5),與預(yù)期一致,說明載體為腺病毒載體,成功構(gòu)建了pAd-EphrinA1-Casp3。

2.5 重組腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3的制備和鑒定

PacI單酶切質(zhì)粒pAd-EphrinA1-Casp3,電泳顯示1個約2.5kb小帶及1個約32kb大帶(圖6),與預(yù)期相符,條帶清晰,表明PacI酶切充分,線性化的重組腺病毒質(zhì)粒DNA的量足夠用于后續(xù)轉(zhuǎn)染工作。線性化的腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293,轉(zhuǎn)染前HEK293細(xì)胞貼壁生長,易于聚集成團,呈現(xiàn)不規(guī)則多邊形、伸展佳、邊界清楚,胞質(zhì)透亮,胞核隱約可見(圖7)。轉(zhuǎn)染后7d出現(xiàn)明顯的CPE現(xiàn)象(圖8),細(xì)胞皺縮變小,間隙增大,繼而腫大、變圓,呈串珠樣改變,約50%細(xì)胞脫壁懸浮。收集和裂解細(xì)胞,離心取上清,獲得重組腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3。以適量上清再次感染HEK 293細(xì)胞,將重組腺病毒的放大培養(yǎng),48h后即有明顯CPE現(xiàn)象,裂解細(xì)胞,收集病毒。PCR擴增腺病毒DNA,電泳(圖9)可見約465bp的清晰條帶,與設(shè)計的目的片段大小一致,表明重組腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3包裝成功,提取的病毒包含預(yù)期目的基因。

圖4 重組質(zhì)粒pEC3.1-EphrinA1-Casp3的Eco RI和Sal I雙酶切電泳.

圖5 重組腺病毒質(zhì)粒pAd-EphrinA1-Casp3的XbaI酶切電泳.

圖6 PacI酶切后線性化質(zhì)粒pAd-EphrinA1-Casp3電泳.

Fig 4 Electrophoresis result of the plasmid pEC3.1-EphrinA1-Casp3 digested with the restriction enzymes EcoR I and Sal I. M： DNA marker； 1： pEC3.1-EphrinA1-Casp3 digested with EcoR I and Sal I.

Fig 5 Electrophoresis result of the plasmid pAd-EphrinA1-Casp3 digested by the restriction enzyme Xba I. M： DNA marker；1： pAd-EphrinA1-caspase-3 digested by Xba I.

Fig 6 Electrophoresis result of the linear plasmid pAd-EphrinA1-Casp3 digested by the restriction enzymes Pac I. M： DNA marker； 1： pAd-EphrinA1-caspase-3 digested by Pac I.

3 討論

3.1 腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體的優(yōu)勢

隨著基因技術(shù)的發(fā)展,基因治療應(yīng)用于臨床已有了可行性。安全有效的載體是成功進行基因治療的先決條件?；蛑委煈?yīng)用的載體可分為兩類： 非病毒式和病毒式[10]。非病毒式載體無致病性,療效易控制,不引起免疫反應(yīng),相對安全,但轉(zhuǎn)染效率低,已轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的DNA易被DNA酶分解,不能在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在和表達,故應(yīng)用較少。病毒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染效率高,目的基因表達穩(wěn)定,在基因治療中占大多數(shù)。用于基因治療的載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、慢病毒等,相比之下,腺病毒載體具有較多優(yōu)點[11-12]： (1) 宿主范圍廣泛,可感染哺乳動物和人體組織多種細(xì)胞,包括任何時期的細(xì)胞(分裂和非分裂);(2) 外源基因表達水平高,轉(zhuǎn)染效果明顯;(3) 適應(yīng)性和穩(wěn)定性好,轉(zhuǎn)染后目的基因持續(xù)表達時間可達一兩周,適合后續(xù)實驗需要;(4) 易于大量制備和純化,病毒滴度高,能滿足臨床要求;(5) 外源基因容量大,并可同時插入多個目的基因;(6) 病毒攜帶的基因不整合至宿主細(xì)胞基因組,以附加體形式存在于染色體之外,在細(xì)胞分裂增殖過程中逐漸丟失;(7) 生物安全性高,基本不致病或僅引起輕微的呼吸道感染癥狀。因此,腺病毒載體明顯優(yōu)于其他轉(zhuǎn)染方法和病毒載體,在基因治療研究和臨床實驗中應(yīng)用較為廣泛,是基因治療比較理想的外源性載體。

3.2 重組腺病毒載體Ad-EphrinA1-Casp3的構(gòu)建

構(gòu)建重組腺病毒系統(tǒng)的策略主要有3種[13]： 體外直接連接(Adeno-X系統(tǒng))、細(xì)菌內(nèi)重組(Adeasy 系統(tǒng))和293細(xì)胞內(nèi)重組(AdMax系統(tǒng))。體外直接連接是傳統(tǒng)酶切連接法,效率低,基因組上適于克隆的酶切位點有限,因而限制了其應(yīng)用。細(xì)菌內(nèi)重組和293細(xì)胞內(nèi)重組是應(yīng)用同源重組原理,都存在構(gòu)建復(fù)雜,篩選費時,效率低等缺陷,還不能完全避免野生型病毒產(chǎn)生。因此,構(gòu)建一種簡單方便、快速高效獲得重組腺病毒的方法一直是腺病毒載體研究的熱點和難點。

圖7 轉(zhuǎn)染pAd-EphrinA1-Casp3前HEK 293細(xì)胞形態(tài),倒置顯微鏡,×100.

圖8 收集病毒前HEK 293細(xì)胞形態(tài),倒置顯微鏡,×100.

Fig 7 Morphological observation of HEK 293 before transfection of pAd-EphrinA1-Casp3,inverted microscope,×100.

Fig 8 Morphological observation of HEK 293 before collection of rAd-EphrinA1-Casp3,inverted microscope,×100.

圖9 重組腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3 PCR產(chǎn)物電泳.

Fig 9 Electrophoresis result of PCR product of the rAd-EphrinA1-caspase-3. M： DNA marker； 1： PCR product of the rAd-EphrinA1-Casp3.

由Invitrogen公司開發(fā)的GatewayTM技術(shù)是一種通用型克隆方法[14],它基于l噬菌體位點特異性高效重組系統(tǒng)(attL×attR→attB×attP),在LR Clonase Ⅱ酶介導(dǎo)下進行體外重組,attL與attR發(fā)生準(zhǔn)確的重組反應(yīng),形成包含attB、attP位點的產(chǎn)物質(zhì)粒。本實驗將目的基因EphrinA1-caspase-3片段亞克隆到包含兩個attL(attLl、attL2)位點的穿梭載體pEC3.1(+)中,形成穿梭質(zhì)粒pEC3.1-EphrinA1-Casp3；用穿梭質(zhì)粒和帶有兩個attR(attRl、attR2)位點的腺病毒骨架載體pAd/pl-DEST(圖1),在重組酶作用下體外重組,實質(zhì)是在pEC3.1-EphrinA1-Casp3中的attL(attLl、attL2)位點與pAd/pl-DEST的attR(attRl、attR2)位點,兩特異性位點間發(fā)生重組反應(yīng),EphrinA1-caspase-3表達框轉(zhuǎn)入pAd/pl-DEST,替換其中的attR基因,反應(yīng)嚴(yán)格保守,保持方向和開放閱讀碼框ORF不變,整個反應(yīng)只需在25℃下持續(xù)1h,具有高效性。

該技術(shù)還利用ccdB選擇方法,穿梭質(zhì)粒pEC3.1-EphrinA1-Casp3和表達載體pAd/pl-DEST重組時,pAd/pl-DEST中的ccdB被EphrinA1-caspase-3基因取代,生成pAd-EphrinA1-Casp3和帶attP的副產(chǎn)品,將這些反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10,氨芐LB平板只能篩選出帶表達克隆pAd-EphrinA1-Casp3的細(xì)胞,帶attR的表達載體pAd/pl-DEST和帶attP反應(yīng)副產(chǎn)物的細(xì)胞都不生長,避免了以往構(gòu)建方法中復(fù)雜的重組子篩選和反復(fù)純化過程,高效率地分離出重組克隆pAd-EphrinA1-Casp3。經(jīng)包裝制備重組腺病毒,縮短了構(gòu)建周期,提高了構(gòu)建效率,為下一步在體內(nèi)、外水平,以重組腺病毒介導(dǎo)目的基因修飾人外周血T淋巴細(xì)胞,使之分泌靶向促凋亡蛋白EphrinA1-caspase-3,誘導(dǎo)EphA2陽性乳腺癌細(xì)胞凋亡奠定了實驗基礎(chǔ),為腫瘤基因治療提供了一種新策略。